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HTRF GAPDH HOUSEKEEPING KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

本检测旨在测量细胞和组织中内源性甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达水平，以对目标磷酸化蛋白和 / 或总蛋白的检测数据进行归一化处理。GAPDH 是一种关键的糖酵解酶，在所有细胞和组织中均持续稳定表达。其氨基酸序列在哺乳动物物种间具有高度同源性。这些特性使其成为最常用的管家蛋白之一。GAPDH 的浓度与细胞数量和总蛋白浓度成正比，因此可作为数据归一化的内参，用于校正由实验变异性（如处理后培养板中剩余细胞数量或裂解效率）引起的信号变化。仅需 4 µL 的样本体积，且与所有 HTRF 磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液兼容，可从同一裂解物中进行多参数分析，同时检测 GAPDH 与目标磷酸化蛋白和 / 或总蛋白。

工作原理

GAPDH 管家蛋白检测原理

GAPDH 管家蛋白检测用于测量细胞或组织裂解物中的内源性 GAPDH。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。GAPDH 管家蛋白检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 GAPDH 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的形式，可评估由实验变异性引起的任何变化。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

GAPDH 管家蛋白双板检测方案

该检测采用双板检测方案，即在培养板中接种细胞并进行处理。在检测步骤中，将 4 µL 裂解物转移至小体积 96 孔或 384 孔白色板中，加入 12 µL 试剂盒稀释液，然后加入 4 µL HTRF® 试剂。该方案能够在合适的细胞培养板中监测细胞的活力和汇合度。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

检测验证

对不同物种的不同细胞模型的验证

将贴壁细胞系 HeLa（人）、NIH-3T3（小鼠）、GH1（大鼠）和 CHO-K1（仓鼠）以不同细胞密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。将悬浮人细胞系 Jurkat 以 30 µL 的体积接种到 96 孔半区板中，细胞密度不同，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后直接用 10 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（4X）裂解。为了用 HTRF 检测 GAPDH 水平，将 4 µL 细胞裂解物（未稀释或在补充的裂解缓冲液中预稀释）转移至小体积白色微孔板中，加入 12 µL 11 号稀释液，然后加入 4 µL 预混合的检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒适用于不同物种的贴壁细胞和悬浮细胞。已在人、小鼠、大鼠和仓鼠来源的样品上验证，也与猴物种兼容。检测范围和灵敏度已在最常用的细胞系和细胞密度上进行了优化。对于某些高表达 GAPDH 的细胞模型，裂解物必须在转移到检测板之前用补充的 1X 裂解缓冲液预稀释（例如，NIH-3T3 和 CHO-K1 裂解物预稀释 1/4；Jurkat 细胞裂解物预稀释 1/5）。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

与 HTRF 磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液的兼容性

将 GH1 细胞以不同密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时，然后用 HTRF 磷酸化 - 总蛋白 1 号、2 号、3 号或 4 号裂解缓冲液（补充有封闭试剂）裂解。为了用 HTRF 检测 GAPDH 水平，将 4 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，加入 12 µL 11 号稀释液，然后加入 4 µL 预混合的检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

该检测与所有磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液兼容。使用 1 号裂解缓冲液时性能最佳。然而，其他三种裂解缓冲液即使在最低细胞密度下也能提供良好的检测窗口（信噪比 > 8）。这些结果表明，GAPDH 管家蛋白检测可在用于磷酸化和总蛋白检测的同一裂解物上进行。有关更多信息，请参考裂解缓冲液兼容性表。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

在磷酸化和总蛋白检测的同时对 GAPDH 水平的控制

MEK 抑制剂 PD98059 对 HeLa 细胞中 ERK 抑制的研究

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育 24 小时后，用不同浓度的 MEK 抑制剂 PD98059 处理 30 分钟。用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞后，将同一裂解物依次转移至小体积检测白色板中：两次 16 µL 用于使用 HTRF Advanced 磷酸化 ERK 和总 ERK 试剂盒（64AERPET/G/H 和 64NRKPET/G/H）联合分析磷酸化 ERK 和总 ERK 水平，另外 4 µL（补充 12 µL 11 号稀释液）用于使用 HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒检测 GAPDH 水平。加入 4 µL 相应的试剂盒检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

随着 PD98059 剂量的增加，ERK 磷酸化的抑制作用增强。由于 ERK 磷酸化的抑制并未伴随总 ERK 或 GAPDH 水平的降低，因此可以排除毒性是其可能的作用机制之一。因此，可以确定 PD98059 主要通过靶向 ERK 的上游激酶 MEK 来降低 ERK 磷酸化。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

IGF-1 对 HEK293 细胞中 AKT 激活的研究

将 HEK293 细胞接种到 96 孔培养板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育 24 小时后，用不同浓度的人 IGF-1 处理 10 分钟。用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞后，将同一裂解物依次转移至小体积检测白色板中：两次 16 µL 用于使用 HTRF 磷酸化 AKT（Ser473）和总 AKT 试剂盒（64AKSPET/G/H 和 64NKTPET/G/H）联合分析磷酸化 AKT 和总 AKT 水平，另外 4 µL（补充 12 µL 11 号稀释液）用于使用 HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒检测 GAPDH 水平。加入 4 µL 相应的试剂盒检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

IGF-1 刺激细胞会诱导 AKT 在 Ser473 位点的磷酸化增加，并下调 AKT 的表达水平，两者均呈剂量依赖性，且 EC50 和 IC50 值相近。另一方面，GAPDH 水平保持不变，这表明总 AKT 的减少并非由整体蛋白质合成受抑制或实验问题引起。这个例子清楚地说明，需要分析目标磷酸化蛋白、总蛋白以及 GAPDH，才能正确理解化合物对蛋白质的影响。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

与 BCA 蛋白检测的相关性

按照第一部分所述方法制备以不同细胞密度接种到 96 孔板中的 Jurkat、CHO-K1、HeLa 和 NIH-3T3 细胞系的裂解物。使用 HTRF 检测测量这些样品中管家蛋白 GAPDH 的水平。同时，按照制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测（QuantiPro™ BCA 检测试剂盒，Sigma-Aldrich）测定同一裂解物中的蛋白浓度。对于这两种方法，裂解物均未经稀释或在适当的缓冲液中预稀释后进行分析，以确保所有样品均在各自检测的线性范围内进行测试。每个图表均表示 HTRF GAPDH 的信噪比（S/N）与 BCA 法测定的蛋白浓度之间的关系。各点旁标注了用于相关性分析的细胞密度。

在人、小鼠或仓鼠细胞系中，HTRF 检测的 GAPDH 水平与 BCA 法测定的蛋白浓度始终具有良好的相关性（相关系数 r > 0.97）。这些结果表明，GAPDH 是一种合适的管家蛋白，可用于检测化合物对目标蛋白的影响。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

对组织样品的验证

用补充的 3 号裂解缓冲液匀浆三只不同小鼠的肝脏组织样品，用补充的 4 号裂解缓冲液裂解一份大鼠肝脏组织样品。按照技术说明制备和分析样品。使用 HTRF 检测测量这些样品中管家蛋白 GAPDH 的水平。同时，按照制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测（QuantiPro™ BCA 检测试剂盒，Sigma-Aldrich）测定同一裂解物中的蛋白浓度。对于这两种方法，裂解物在适当的缓冲液中预稀释后进行分析（稀释倍数从 1/50 到 1/200），以确保所有样品均在各自检测的线性范围内进行测试。

GAPDH 管家蛋白检测与不同物种的组织裂解物兼容。该检测的灵敏度能够轻松检测到蛋白浓度低于 0.1 mg/mL 的样品中的 GAPDH。HTRF 检测的 GAPDH 水平与 BCA 法测定的蛋白浓度始终具有良好的相关性。这些结果表明，GAPDH 是一种合适的管家蛋白，可用于组织样品的归一化，以研究化合物在动物模型中的作用。

GAPDH 管家蛋白细胞检测试剂盒

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：50,000 个检测点

没有数据

货号：64GAPDHPEY

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