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HTRF GSK3 ALPHA P-S21 KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述

磷酸化 GSK3a（Ser21）检测旨在对丝氨酸 21（Ser21）位点磷酸化的 GSK3a 调控进行稳健定量，以此作为主要通路的通用检测指标。GSK3 参与 PI3K/AKT 信号通路、Wnt/β- 连环蛋白通路、 Hedgehog 通路、Notch 通路、糖原合成以及细胞骨架聚合，这些过程控制着蛋白质合成、细胞增殖、迁移、炎症、免疫反应、葡萄糖调节和细胞凋亡。

工作原理

磷酸化 GSK3a（Ser21）检测原理

磷酸化 GSK3a（Ser21）检测用于测定丝氨酸 21（Ser21）位点磷酸化的 GSK3a。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 GSK3a（Ser21）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 GSK3a（Ser21）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 GSK3a（Ser21）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 GSK3a（Ser21）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 GSK3a（Ser21）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

HTRF 检测与使用磷酸化 GSK3a、总 GSK3a 的蛋白质印迹法比较

人 MCF-7 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度。用 1.72 µM 胰岛素刺激 30 分钟后，弃去细胞培养基，用 3 mL 补充的裂解缓冲液在室温下裂解细胞 30 分钟。10 分钟离心后收集可溶性组分。在补充的裂解缓冲液中对细胞裂解物进行系列稀释，分装 16 µL 各稀释液，通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。使用 HTRF 磷酸化 GSK3a（Ser21）和总 GSK3a 细胞检测时，仅需 1500 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法信号则需要 12500 个细胞。HTRF 细胞检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

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UCN-01 对 GSK3 磷酸化的抑制作用（使用磷酸化 GSK3a 检测）

将 100,000 个人 MCF-7 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用浓度递增的 UCN-01 孵育 2 小时后，用 1.72 µM 胰岛素刺激 30 分钟。随后移除培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 GSK3a（Ser21）检测试剂。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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胰岛素对 MCF-7 细胞的剂量反应（使用磷酸化 GSK3a（Ser21）细胞检测）

将 100,000 个人 MCF-7 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用浓度递增的胰岛素孵育 30 分钟后，移除培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 GSK3a（Ser21）检测试剂。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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HTRF 磷酸化 GSK3a（Ser21）细胞检测与不同细胞系的兼容性

将 100,000 或 200,000 个不同细胞系的细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 1 µg/mL UCN-01 或不加 UCN-01 孵育 2 小时后，用 1.72 µM 胰岛素刺激 30 分钟。移除培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 GSK3a（Ser21）检测试剂。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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简化通路

GSK3a 简化通路

GSK3a 在众多核心细胞内信号通路中具有活性，调控着从增殖、免疫反应到葡萄糖调节和细胞凋亡等重要细胞过程。GSK3 激酶的磷酸化会抑制下游靶标的活性。GSK3 还受细胞定位和蛋白质复合物形成的调控。在胰岛素通路中，胰岛素激活 PI3K，PI3K 进而磷酸化 AKT。随后，激活的 AKT 使 GSK3a 的 Ser21 位点和 GSK3β 的 Ser9 位点磷酸化，导致 GSK-3 失活，并通过去磷酸化诱导糖原合成酶激活。去磷酸化的 GSK3 使糖原合成酶失活，而糖原合成酶可将葡萄糖转化为糖原。因此，GSK3 被认为是多种疾病研究应用中极具潜力的多功能靶点。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/ 纤维化
单位规格：10,000 个检测点

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