HTRF (H) GSPT1 TOTAL KIT - 50K PTS

概述

GSPT1（G1至S期转换蛋白1）主要以其在蛋白质合成终止中的作用而闻名，如今已成为药物研发的热门靶点。在靶向蛋白质降解领域尤其如此，因为在某些癌症（包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及急性髓系淋巴瘤）中已观察到GSPT1水平升高。此外，GSPT1可能会导致癌细胞产生化疗耐药性。其过表达会降低癌细胞对抗癌药物的敏感性，这使其成为克服耐药性的潜在治疗靶点。 工作原理 总GSPT1检测原理 HTRF总GSPT1检测可对细胞裂解物中GSPT1的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总GSPT1检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在GSPT1时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。 human-total-gspt1-detection-kit-1.svg 总GSPT1双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到384孔小体积检测板中，之后再加入总GSPT1 HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。 human-total-gspt1-detection-kit 人总GSPT1单板检测方案 使用HTRF试剂检测总GSPT1可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的HTRF质量。 human-total-gspt1-detection-kit 检测验证 使用分子胶在HAP-1细胞上对HTRF总GSPT1进行调控 将HAP-1野生型（WT）或脑衰蛋白（Cereblon）敲除细胞系以30,000个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中。在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时后，用浓度递增的分子胶CC-885、CC-90009或SJ6986处理细胞，这些分子胶据报道可诱导GSPT1降解。 处理24小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入50µL补充的裂解缓冲液#4（1X）。接着，将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4µL HTRF GSPT1检测抗体。另外，还将4µL裂解物（补充有12µL稀释剂#8）转移到微孔板中，使用α-微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPET/G/H）检测α-微管蛋白水平。孵育过夜后记录HTRF信号。 这三种分子胶在HAP-1 WT细胞中引发了GSPT1的剂量依赖性减少，而在HAP-1脑衰蛋白敲除细胞中，GSPT1水平未受到显著调控。此外，α-微管蛋白的表达水平保持不变。与文献一致，我们的结果表明，CC-885、CC-90009以及SJ6986诱导的GSPT1降解依赖于脑衰蛋白。 human-total-gspt1-detection-kit human-total-gspt1-detection-kit 使用分子胶在人非小细胞肺癌NCI-H358细胞上对HTRF总GSPT1进行调控 将人非小细胞肺癌NCI-H358细胞以30,000个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，在37°C、5% CO₂条件下培养24小时。用浓度递增的分子胶MRT-2359处理细胞4小时或24小时。在加入MRT-2359前1小时，加入或不加入1µM的蛋白酶体抑制剂环氧霉素。 处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入50µL补充的裂解缓冲液#4（1X）。然后将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4µL HTRF GSPT1检测抗体。另外，还将4µL裂解物（补充有12µL稀释剂#8）转移到微孔板中，使用α-微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPEG）检测α-微管蛋白水平。孵育过夜后记录HTRF信号。 分子胶MRT-2359诱导GSPT1蛋白呈剂量依赖性减少，处理4小时和24小时后的DC50*分别为153nM和93nM。此外，环氧霉素可阻止MRT-2359诱导的GSPT1降解，这清楚地表明泛素-蛋白酶体系统参与了MRT-2359介导的GSPT1降解。 DC50指的是使50%的靶蛋白降解的降解剂浓度。 human-total-gspt1-detection-kit 使用siRNA对HTRF总GSPT1检测的特异性验证 将HEK293细胞以10,000个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。然后用针对GSPT1或GSPT2的特异性siRNA以及阴性对照siRNA转染细胞。孵育48小时后，裂解细胞，将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF总GSPT1检测抗体。孵育过夜后记录HTRF信号。 与转染阴性siRNA的细胞相比，转染GSPT1 siRNA的细胞信号降低了70%。在转染GSPT2 siRNA的细胞中未观察到信号降低。在相同的实验条件下，未观察到细胞毒性作用，这通过ATPlite™检测所测量的ATP水平得到证实（数据未显示）。这些结果证明了HTRF总GSPT1检测试剂盒的检测特异性。 human-total-gspt1-detection-kit HTRF与蛋白质印迹法检测总GSPT1的敏感性比较 将HEK293细胞在含有完全培养基的T175培养瓶中培养，在37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。 移除培养基后，用3mL补充的裂解缓冲液#4（1x）在室温下轻轻摇动裂解细胞30分钟。 使用补充的裂解缓冲液#4（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，将16µL纯样品和每个稀释液转移到384孔小体积微孔板中，然后加入4µL HTRF总GSPT1检测抗体。孵育过夜后记录HTRF信号。 将等量的裂解物上样到凝胶中，用于HTRF和蛋白质印迹法的平行比较。 在这些条件下，HTRF总GSPT1检测的敏感性是蛋白质印迹法的256倍。 human-total-gspt1-detection-kit 简化通路 GSPT1信号通路 当核糖体被招募到mRNA的5'端时，翻译启动。eIF4E结合蛋白（如4EBP1）通过与eIF4E结合并阻止翻译机制的招募来阻断翻译。mTOR对4EBP1的过度磷酸化会消除其与eIF4E的结合活性，从而促进翻译。 GSPT1也称为真核释放因子3a（eRF3a），作为一种小GTP酶发挥作用，介导终止密码子的识别。 GSPT1通过其C端与另一种真核释放因子eRF1相互作用，形成翻译终止复合物的一部分，当终止密码子进入核糖体的A位点时，促使蛋白质解离。 human-total-gspt1-detection-kit规格

其他规格 应用 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 裂解缓冲液兼容性 裂解缓冲液1 裂解缓冲液3 裂解缓冲液4 分子修饰 总（蛋白） 产品类别 试剂盒 样品体积 16µL 运输条件 干冰运输 靶标类别 磷蛋白 靶标物种 人 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 单位规格 500个检测点