概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会诱导染色质构象压缩，进而抑制基因转录，这一过程参与多种生理活动。

重要的是，HDACs 在多种脑部疾病中存在失调现象，与自闭症、阿尔茨海默病、抑郁症等疾病的发病机制密切相关。这表明 HDACs 可能成为脑部疾病治疗的潜在靶点。

在 II 类 HDACs 中，HDAC4 是缺血性脑卒中治疗的特异性靶点。它在缺血性脑卒中的发病机制中发挥关键作用，并通过影响神经元死亡、血管生成和神经发生参与卒中后的恢复过程。

表观遗传通路定义了人类癌症中具有生物学意义的亚群。EZH2 激活和 HDAC4 激活分别与生长因子信号传导和炎症相关，代表了癌细胞的两种不同状态。这一认识有助于我们识别乳腺癌和间质型胶质母细胞瘤中可靶向的驱动因子。

工作原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测用于测定丝氨酸 246（Ser246）位点磷酸化的 HDAC4。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 HDAC4（Ser246）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 HDAC4（Ser246）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 HDAC4（Ser246）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HDAC4（Ser246）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

使用磷酸化 HDAC4（Ser246）和总 HDAC4 在 MOLT-4 细胞上进行抑制剂表征

将 MOLT-4 细胞（永生化人急性 T 淋巴细胞白血病细胞）以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% CO₂条件下用浓度递增的福司柯林（Forskolin）或 H-1152 处理 2 小时后，向每个孔中加入 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻摇晃 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 HDAC4 或磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

福司柯林是一种细胞渗透性化合物，可直接激活腺苷酸环化酶（产生环磷酸腺苷（cAMP）的酶），导致细胞内 cAMP 水平升高。cAMP 是一种重要的第二信使，参与许多信号转导通路，包括蛋白激酶 A（PKA）的激活。已有研究表明，经福司柯林处理的细胞中磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平会降低。

H-1152 被描述为一种膜渗透性的钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）抑制剂，其半数抑制浓度（IC50）约为 180nM。

正如预期，结果显示用福司柯林和 H-1152 处理后，HDAC4 在 Ser246 位点的磷酸化受到明显的剂量依赖性抑制，而 HDAC4 蛋白的表达水平保持稳定。

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使用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（40,000 个细胞 / 孔），用 150 µL 培养基将 MOLT-4 细胞与 2µM 的 SMARTPool Accell siRNA（Horizon 公司）共孵育 96 小时，其中 siRNA 分别特异性靶向 HDAC4（货号 #E-003497-00-0020）和 HDAC5（货号 #E-003498-00-0020），并以非靶向 siRNA（货号 #D-001910-10-05）作为对照。通过离心（1400 rpm，8 分钟）移除培养基后，用 50 µL 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，用 HDAC4 siRNA 处理的细胞中 HDAC4 显著下调，信号降低 80%。

尽管 IIa 类蛋白之间具有高度同源性，但用 HDAC5 siRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

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在多种人和小鼠细胞系上的验证

贴壁人细胞系：HeLa（宫颈）、HEK293（肾）和小鼠细胞系 NIH3T3 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。

悬浮免疫人细胞系 MOLT-4、Jurkat 和 THP-1（急性白血病）以 30 µL 体积、150,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解 30 分钟。

使用 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）试剂盒评估磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂，在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在悬浮和贴壁细胞系中均可检测到不同水平的磷酸化 HDAC4（Ser246）蛋白。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度以确保检测在试剂盒的动态范围内进行。

HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的人细胞模型以及小鼠模型（如 NIH3T3 细胞系）中的内源性磷酸化 HDAC4 蛋白。

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HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测与蛋白质印迹法的比较

将 MOLT-4 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 8 倍。

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简化通路

HDAC4 信号通路

HDAC4 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。

响应应激信号时，包括蛋白激酶 C（PKC）、蛋白激酶 D（PKD）和钙 / 钙调蛋白依赖性激酶（CaMK）在内的激酶会直接磷酸化 HDAC4，触发其从细胞核向细胞质输出。磷酸化的 HDAC4 与 14-3-3 蛋白结合并滞留于细胞质中，细胞质形式的 HDAC4 可能具有蛋白去乙酰化酶活性。压迫刺激会增加 PP2A 的活性，导致 HDAC4 去磷酸化，随后 HDAC4 与 14-3-3 蛋白分离并重新定位到细胞核中，从而抑制转录因子。

Runx2 编码肽酶 M10 家族基质金属蛋白酶（MMPs）的一个成员。该家族蛋白参与正常生理过程（如胚胎发育、繁殖和组织重塑）以及疾病过程（如关节炎和转移）中的细胞外基质降解。

MEF2 是一类在肌肉细胞分化和凋亡中起重要作用的转录因子。

此外，HDAC4 通过与 STAT1 相互作用并对其去乙酰化，促进 STAT1 的磷酸化和激活。激活的 STAT1 随后转移到细胞核中诱导基因表达，进而引发炎症和凋亡，并抑制自噬。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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HTRF (H/M) HDAC4 P-S246 KIT - 10K PTS 人和小鼠磷酸化组蛋白脱乙酰酶4(丝氨酸246)检测试剂盒，10000测试

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工作原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）双板检测方案

磷酸化 HDAC4（Ser246）单板检测方案

检测验证

使用磷酸化 HDAC4（Ser246）和总 HDAC4 在 MOLT-4 细胞上进行抑制剂表征

使用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测的特异性和选择性

在多种人和小鼠细胞系上的验证

HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

HDAC4 信号通路

规格

其他规格