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HTRF (H/M) HDAC4 P-S246 KIT - 50K PTS

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概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白的乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会导致染色质构象凝聚，进而抑制基因转录，这一过程参与多种生理活动。

重要的是，组蛋白去乙酰化酶在多种脑部疾病中存在失调情况，这与自闭症、阿尔茨海默病、抑郁症等疾病的发病机制相关，表明组蛋白去乙酰化酶可能是治疗脑部疾病的潜在靶点。

在 II 类组蛋白去乙酰化酶中，HDAC4 是治疗缺血性脑卒中的特异性靶点。它在缺血性脑卒中的发病机制中，以及在脑卒中后的恢复过程中（通过影响神经元死亡、血管生成和神经发生）都发挥着关键作用。

表观遗传通路决定了人类癌症中与生物学相关的亚群。EZH2 激活和 HDAC4 激活分别与生长因子信号传导和炎症相关，代表了癌细胞的两种不同状态。这一认识可能使我们能够识别乳腺癌和间充质胶质母细胞瘤中可靶向的驱动因子。

工作原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测原理

磷酸化 HDAC4（Ser246）检测用于测量在 Ser246 位点发生磷酸化的 HDAC4。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 HDAC4（Ser246）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态的影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并且提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

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磷酸化 HDAC4（Ser246）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化 HDAC4（Ser246）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 HDAC4（Ser246）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HDAC4（Ser246）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

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检测验证

在 MOLT-4 细胞上使用磷酸化 HDAC4（Ser246）和总 HDAC4 进行抑制剂表征

将 MOLT-4 细胞（永生化的人类急性 T 淋巴细胞白血病细胞）以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中。在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的福司柯林（Forskolin）或 H-1152 处理 2 小时后，向每个孔中加入 10µl 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µl 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µl HTRF 总 HDAC4 或磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

福司柯林是一种可渗透细胞的化合物，能直接激活腺苷酸环化酶（该酶可产生环磷酸腺苷（cAMP））。其结果是细胞内 cAMP 水平升高。cAMP 是一种重要的第二信使，参与许多信号转导通路，包括蛋白激酶 A（PKA）的激活。已有研究表明，经福司柯林处理的细胞中，磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平会降低。

H-1152 被描述为一种膜渗透性的钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）抑制剂，其半数抑制浓度（IC50）约为 180nM。

正如预期的那样，所得结果显示，用福司柯林和 H-1152 处理后，HDAC4 在 Ser246 位点的磷酸化受到明显的剂量依赖性抑制，而 HDAC4 蛋白的表达水平保持不变。

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使用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（每孔 40,000 个细胞），用 2µM 的 SMARTPool Accell siRNA（Horizon 公司产品）分别特异性靶向 HDAC4（货号 #E-003497-00-0020）和 HDAC5（货号 #E-003498-00-0020）处理 MOLT-4 细胞，同时以非靶向 siRNA（货号 #D-001910-10-05）作为对照，在 150µL 体系中处理 96 小时。通过离心（1400 转 / 分钟，8 分钟）去除培养基后，在室温下用 50µL 1X 裂解缓冲液 #4 轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，再加入 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。在室温下 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，用 HDAC4 siRNA 处理的细胞中 HDAC4 显著下调，信号降低了 80%。

尽管 IIa 类蛋白之间具有高度同源性，但用 HDAC5 siRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

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在多种人类和小鼠细胞系上的验证

贴壁人类细胞系：将 HELA 细胞（宫颈癌细胞）、HEK293 细胞（肾细胞）以及小鼠细胞系 NIH3T3 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，在室温下用 50µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

悬浮免疫人类细胞系 MOLT-4、JURKAT 和 THP-1（急性白血病细胞）以 30µL 的体积接种到 96 孔板中，密度为 150,000 个细胞 / 孔，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后在室温下用 10µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用 HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）试剂盒评估磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

在悬浮和贴壁细胞系中，均可不同程度地良好检测到磷酸化 HDAC4（Ser246）蛋白。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度，使其处于试剂盒的动态范围内。

HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测能够有效检测各种人类细胞模型（表达不同水平的该蛋白）以及小鼠模型（如 NI3T3 细胞系）中的内源性磷酸化 HDAC4 蛋白。

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HTRF 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测与蛋白质印迹法的比较

在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养 MOLT-4 细胞，置于 37°C、5% CO₂环境中。孵育 24 小时后，在室温下用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 磷酸化 HDAC4（Ser246）检测试剂。取等量的裂解物用于 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

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简化通路

HDAC4 信号通路

HDAC4 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。

响应应激信号时，包括蛋白激酶 C（PKC）、蛋白激酶 D（PKD）和钙 / 钙调蛋白依赖性激酶（CaMK）在内的激酶会直接磷酸化 HDAC4，促使其从细胞核输出到细胞质。磷酸化的 HDAC4 与 14-3-3 蛋白结合并滞留于细胞质中。细胞质形式的 HDAC4 可能具有蛋白质去乙酰化酶活性。压迫刺激会增强 PP2A 的活性，导致 HDAC4 去磷酸化，随后 HDAC4 与 14-3-3 蛋白分离并重新定位到细胞核，从而抑制转录因子。

Runx2 编码基质金属蛋白酶（MMPs）的肽酶 M10 家族的一个成员。该家族的蛋白质参与正常生理过程（如胚胎发育、生殖和组织重塑）以及疾病过程（如关节炎和转移）中细胞外基质的分解。

MEF2 是一组在肌肉细胞分化和凋亡中起重要作用的转录因子。

此外，HDAC4 通过与 STAT1 相互作用并对其去乙酰化，促进 STAT1 的磷酸化和激活。激活后的 STAT1 转移到细胞核中诱导基因表达，进而引发炎症和凋亡，并抑制自噬。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64HDAC4S6PEY

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