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HTRF (H/M) HDAC5 P-S259 KIT - 500 PTS

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概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会诱导染色质构象压缩，进而抑制基因转录，这一过程参与多种生理活动。

HDAC5 属于 IIa 类 HDACs，该家族还包括 HDAC4、HDAC7 和 HDAC9。它在调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡和代谢过程中发挥关键作用。

工作原理

磷酸化 HDAC5（Ser259）检测原理

HTRF 磷酸化 HDAC5（Ser259）检测用于测定丝氨酸 259（Ser259）位点磷酸化的 HDAC5。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 HDAC5（Ser259）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 HDAC5（Ser259）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 HDAC5（Ser259）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 HDAC5（Ser259）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HDAC5（Ser259）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

THP1 细胞上 HDAC5 Ser259 磷酸化的抑制实验

将 THP1 人细胞（急性单核细胞白血病细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在含完全培养基的条件下，于 37°C、5% CO₂环境中用浓度递增的星形孢菌素（激酶抑制剂）或福司柯林（腺苷酸环化酶激活剂）处理 2 小时。处理后，向每个孔中加入 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻摇晃 30 分钟（按悬浮细胞方案操作）。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 HDAC5（Ser259）或总 HDAC5 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。需注意，细胞密度已预先优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未展示）。

正如预期，结果显示两种不同机制均可触发 HDAC5 在 Ser259 位点的磷酸化呈剂量依赖性抑制：①星形孢菌素通过抑制 CaMKII 激酶发挥作用；②福司柯林激活 cAMP 通路，导致 PKD 抑制，进而使 Ser259 位点磷酸化的 HDAC5 减少。使用这两种化合物处理后，总 HDAC5 蛋白的表达水平几乎保持恒定。

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使用 siRNA 验证 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测的特异性

将 THP1 细胞以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，然后转染 5µM 的 HDAC5 特异性 siRNA、其他 IIa 类家族成员（HDAC4、HDAC7、HDAC9）的特异性 siRNA，以及阴性对照 siRNA。孵育 24 小时后，用补充的 4X 裂解缓冲液 #4 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测抗体（按悬浮细胞方案操作）。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 HDAC5 特异性 siRNA 的细胞信号降低 77%，而使用 HDAC4、HDAC7 或 HDAC9 的 siRNA 则未观察到任何影响。

综上，这些数据表明 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测具有特异性，且不会与其他 IIa 类 HDAC 家族成员发生交叉反应（HDAC4 与 HDAC5 的序列同源性超过 60%）。

siRNA 产品参考（Horizon Discovery）：Accell 人 HDAC4 siRNA #E-003497-00-0050；Accell 人 HDAC5 siRNA #E-003498-00-0050；Accell 人 HDAC7 siRNA #E-009330-00-0050；Accell 人 HDAC9 siRNA #E-005241-00-0050

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在多种人和小鼠细胞系上的验证

将贴壁细胞系 HEK293、HEK293T（人胚胎肾细胞）和 NIH3T3（小鼠成纤维细胞）接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A（磷酸酶抑制剂）处理细胞 1 小时，移除培养基后，用 25 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。

将悬浮人细胞 THP1（急性单核细胞白血病细胞）接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A 处理 1 小时。处理后，用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟（按悬浮细胞方案操作）。

使用 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 试剂盒评估 Ser259 位点磷酸化的 HDAC5 表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂，在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。需注意，细胞密度已预先优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据显示 HEK293、HEK293T 和 THP1 细胞的密度为 200,000 个细胞 / 孔，NIH3T3 细胞为 50,000 个细胞 / 孔时，蛋白质表达水平显著更高）。

HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的内源性 pS259-HDAC5。

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HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测与蛋白质印迹法的比较

将 THP1 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养，孵育 24 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

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简化通路

HDAC5 信号通路

HDAC5 在调控参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等功能的基因中发挥关键作用。HDAC5 在细胞核内的积累由 N 端核定位信号（NLS）和 C 端核输出信号的活性平衡所调控。因此，HDAC5 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。有研究报道，cAMP 信号传导会促进 HDAC5 在细胞核内的积累。HDAC5 可被 CaMK 激酶磷酸化，随后被转运至细胞质并与 14-3-3 伴侣蛋白结合滞留。虽然 CaMKII 不能直接与 HDAC5 结合，但 HDAC5 与 HDAC4 的异源寡聚化可使 CaMKII 磷酸化 HDAC5。14-3-3 蛋白与 HDAC4 或 HDAC5 的结合足以诱导 HDAC4-HDAC5 复合物向核外输出，从而激活被 IIa 类 HDACs 抑制的转录因子（如 MEF2）。

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规格

其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64HDAC5S9PEG

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