HTRF (H/M) HDAC5 TOTAL KIT - 50K PTS

概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白的乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会导致染色质构象凝聚，进而抑制基因转录，这一过程参与多种生理活动。 HDAC5 属于 IIa 类组蛋白去乙酰化酶，该类别还包括 HDAC4、HDAC7 和 HDAC9。它在细胞增殖、分化、迁移、凋亡及代谢的调控中发挥关键作用。 作用原理 总 HDAC5 检测原理 HTRF 总 HDAC5 检测可对细胞裂解物中 HDAC5 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 HDAC5 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都能高度特异性地识别该蛋白上的不同表位。当细胞提取物中存在 HDAC5 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。该信号的强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 总 HDAC5 双板检测方案 双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，之后再加入总 HDAC5 HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 总 HDAC5 单板检测方案 使用 HTRF 试剂检测总 HDAC5 可在单个培养板中完成，该培养板可用于细胞培养、刺激和裂解，且无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 检测验证 THP1 细胞中 HDAC5 Ser259 磷酸化的抑制：同时使用磷酸化 HDAC5 Ser259 试剂盒和总 HDAC5 试剂盒进行测量 将人 THP1 细胞（急性单核细胞白血病细胞）以 200,000 个细胞/孔的密度接种到 96 孔板中。在完全细胞培养基中，于 37°C、5% CO₂ 条件下，用不同浓度的星形孢菌素（激酶抑制剂）或福司柯林（腺苷酸环化酶激活剂）处理细胞 2 小时。处理后，向每孔中加入 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液#4，在室温下轻轻振荡 30 分钟（按照悬浮细胞方案操作）。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 HDAC5（Ser259）或总 HDAC5 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。需注意的是，事先已对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。 正如预期，我们的结果显示，通过两种不同机制可触发 Ser259 位点磷酸化 HDAC5 的剂量依赖性抑制：i）星形孢菌素通过抑制 CAMKII 激酶发挥作用；ii）福司柯林激活 cAMP 通路，导致 PKD 抑制，进而使 Ser259 位点磷酸化的 HDAC5 减少。使用这两种化合物处理后，总 HDAC5 蛋白的表达水平几乎保持不变。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 利用 siRNA 验证 HTRF 总 HDAC5 检测的特异性 将 THP1 细胞以 300,000 个细胞/孔的密度接种到 96 孔板中，然后用 5µM 针对 HDAC5 或其他 IIa 类家族成员（HDAC4、HDAC7 或 HDAC9）的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，用补充的 4X 裂解缓冲液#4 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测抗体（按照悬浮细胞方案操作）。孵育过夜后记录 HTRF 信号。 与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 HDAC5 特异性 siRNA 的细胞的信号降低了 65%，而使用针对 HDAC4、HDAC7 或 HDAC9 的 siRNA 则未观察到这种效果。 综上，这些数据表明 HTRF 总 HDAC5 检测具有特异性，不会与其他 IIa 类 HDAC 家族成员发生交叉反应（HDAC4 与 HDAC5 的序列同源性超过 60%）。 siRNA 产品参考（Horizon Discovery）：Accell 人 HDAC4 siRNA #E-003497-00-0050；Accell 人 HDAC5 siRNA #E-003498-00-0050；Accell 人 HDAC7 siRNA #E-009330-00-0050；Accell 人 HDAC9 siRNA #E-005241-00-0050 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 在多种人和小鼠细胞系中的验证 将贴壁细胞系 HEK293、HEK293T（人胚肾细胞）和 NIH3T3（小鼠成纤维细胞）接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。移除培养基后，向每孔中加入 25 µL 补充的 1X 裂解缓冲液#4，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。 将人悬浮细胞 THP1（急性单核细胞白血病细胞）接种到 96 孔板中，加入 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液#4，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞（按照悬浮细胞方案操作）。 使用 HTRF 总 HDAC5 试剂盒评估 HDAC5 的表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。需注意的是，事先已对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据显示为 200,000 个细胞/孔）。 HTRF 总 HDAC5 检测能够有效检测各种细胞模型中内源性 HDAC5 的表达，无论其表达水平高低。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒 简化通路 HDAC5 信号通路 HDAC5 在调控与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等细胞功能相关的基因中起着关键作用。HDAC5 在细胞核内的积累取决于 N 端核定位信号（NLS）和 C 端核输出信号的活性平衡。因此，HDAC5 会根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。据报道，cAMP 信号传导会促进 HDAC5 在细胞核内的积累。HDAC5 被 CAMK 激酶磷酸化后，会被转运到细胞质中，并与 14-3-3 伴侣蛋白结合而被封存。虽然 CaMKII 不能直接与 HDAC5 结合，但 HDAC5 与 HDAC4 的异源寡聚化使 CaMKII 能够磷酸化 HDAC5。14-3-3 蛋白与 HDAC4 或 HDAC5 结合，足以诱导 HDAC4 - HDAC5 复合物向核外输出，从而激活被 IIa 类 HDAC 抑制的转录因子（如 MEF2）。 人 - 鼠总 HDAC5 检测试剂盒规格

其他规格 应用 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 兼容的裂解缓冲液 裂解缓冲液 1 裂解缓冲液 2 裂解缓冲液 3 裂解缓冲液 4 分子修饰 总蛋白 产品类别 试剂盒 样品体积 16 µL 运输条件 干冰运输 目标类别 磷酸化蛋白 目标物种 人 小鼠 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET） 单位规格 500 次检测