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HTRF HER2 P-Y1221/1222 KIT - 500 PTS 磷酸化HER2检测试剂盒 - 500测试

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概述

磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测旨在对 Tyr1221/1222 位点磷酸化的 HER2-Erbb2 调控水平进行稳定定量，该位点磷酸化是多种癌症病理状态的指示标志。人表皮生长因子受体 2（HER2，也称为 ErbB2 受体）的上调与人类乳腺癌及其他多种癌症相关，如卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌和肺癌等，这使得 HER2 成为抗癌治疗的关键靶标。

工作原理

磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测原理

磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测用于测定 Tyr1221/1222 位点磷酸化的 HER2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

HTRF 磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测与蛋白质印迹法的比较

将人 SKOV3 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C 下培养至 80% 汇合度，随后用 100 nM EGF 刺激 10 分钟。移除培养基后，加入 3 mL 补充的裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。使用 HTRF 磷酸化 HER2（Tyr1221/1222）检测时，仅需 1500 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 12,500 个细胞才能产生信号。HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 8 倍，且两者具有良好的相关性。

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多种人类肿瘤细胞系中磷酸化 HER2 的调控实验

将 100,000 个人 SKOV3、SK-BR-3、A431 和 MCF-7 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 mEGF 孵育 10 分钟后，移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 HER2 检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体对磷酸化 HER2 的抑制实验

实验在 SKOV3 细胞上进行。将 100,000 个细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时，随后用剂量梯度的抑制剂（曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗等治疗性单克隆抗体，以及拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂）预处理细胞，再用 mEGF 在 37°C、5% CO₂条件下刺激 10 分钟。上述步骤完成后，移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中进行检测，加入 4 µL HTRF 磷酸化 HER2 检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果表明，HTRF 磷酸化 HER2 检测可用于解析靶向 HER2 的小分子药物和生物制剂的作用机制。

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简化通路

HER2 表皮生长因子信号通路

HER2 是一种受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体（ErbB）家族。HER2 存在于细胞表面，是目前唯一未发现配体的 EGFR 家族成员。HER2 受体激活会诱导其自身 Tyr1221/1222 位点的磷酸化，这为多种衔接蛋白、激酶和磷酸酶提供了停靠位点，进而诱导多个信号转导级联反应的下游激活，主要包括 MAPK/ERK/JNK 通路和 PI3K/AKT 通路。HER2/ErbB 受体的信号转导调控多种生物学过程，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。HER2 的过度激活与癌症相关，这使得 HER2 成为抗癌治疗的关键靶标。

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规格

其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64HR2PEG

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