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HTRF HER3 P-Y1289 KIT - 500 PTS 磷酸化HER3检测试剂盒 - 500测试

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概述

磷酸化 HER3（Tyr1289）检测旨在对 Tyr1289 位点磷酸化状态下 HER3（Erbb3）的调控水平进行稳定定量，该位点的磷酸化是多种癌症病理状态的指示标志。人表皮生长因子受体 3（HER3，又称 ErbB3）的过表达被视为人类乳腺癌预后不良的指标。HER3 与 HER2 的异源二聚化会增加乳腺癌的侵袭性。此外，HER3 还被发现与前列腺癌、胃癌、结肠癌及其他癌症相关，这使得 HER3 成为抗癌治疗的关键靶标。

工作原理

磷酸化 HER3（Tyr1289）检测原理

磷酸化 HER3（Tyr1289）检测用于测定 Tyr1289 位点发生磷酸化的 HER3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 HER3（Tyr1289）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 HER3（Tyr1289）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 HER3（Tyr1289）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 HER3（Tyr1289）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HER3（Tyr1289）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

HTRF 磷酸化 HER3 检测与蛋白质印迹法的比较

乳腺癌细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时，随后用 100 nM HRG Beta1 刺激 10 分钟。移除培养基后，加入 3 mL 补充的裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。使用 HTRF 磷酸化 HER3（Tyr1289）检测时，仅需 5,000 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 80,000 个细胞才能产生信号。HTRF 磷酸化 HER3 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。

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多种乳腺腺癌细胞系中磷酸化 HER3 的调控实验

将 100,000 个人源重组 HER2/HER3 细胞、MCF-7 细胞、SK-BR-3 细胞和乳腺癌细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 HRG Beta3 孵育 10 分钟后，移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 HER3 检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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酪氨酸激酶抑制剂和治疗性抗体对 HER3 磷酸化的抑制实验

将 100,000 个细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后用剂量梯度的抑制剂预处理细胞，再在 37°C、5% CO₂条件下用或不用 100 nM HRG Beta1 刺激细胞。上述步骤完成后，移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中：加入 4 µL HTRF 磷酸化 HER3 检测试剂以检测磷酸化 HER3，加入 4 µL HTRF 总 HER3 检测试剂以检测总蛋白。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼的细胞内抑制作用

人乳腺癌细胞和 SKBR3 细胞用剂量梯度的小分子酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼预处理 30 分钟，随后用 100 nM HRG Beta1 刺激 10 分钟。

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单克隆抗体对磷酸化 HER3 的抑制作用

人乳腺癌 BXPC3 细胞用剂量梯度的单克隆抗体 mAb-X 或 mAb-Y 预处理 30 分钟，随后用 100 nM HRG Beta1 刺激 10 分钟。两种单克隆抗体均由法国蒙彼利埃 IRCM 的 Thierry Chardès 博士友情提供。

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简化通路

HER3 表皮生长因子信号通路

HER3 是一种受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体（ErbB）家族。HER3 存在于细胞表面，是目前唯一未发现配体的 EGFR 家族成员。HER3 受体激活会诱导其自身 Tyr1289 位点的磷酸化，这为多种衔接蛋白、激酶和磷酸酶提供了停靠位点，进而诱导多个信号转导级联反应的下游激活。HER3/ErbB 受体调控多种生物学过程，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。HER3 的过度激活与癌症相关，这使得 HER3 成为抗癌治疗的关键靶标。HER3 与 HER2 的异源二聚化会增加癌症的侵袭性。

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规格

其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64HR3PEG

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