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HTRF JAK3 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

人总 JAK3 检测试剂盒可监测细胞内 JAK3 蛋白水平。

Janus 家族激酶（JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK2）属于非受体蛋白酪氨酸激酶，它们通过细胞因子受体（主要是白细胞介素受体和干扰素受体）传递下游信号，并激活 STAT 转录因子。特定的 JAK/JAK 组合与特定受体结合，为下游 JAK/STAT 信号通路赋予特异性。JAK3 与 JAK1 共同作用，专门与 IL-2Rγ 家族受体结合，进而触发转录因子 STAT1、STAT3、STAT5 和 STAT6 的激活，以调控淋巴细胞的成熟、存活、激活和分化。

已有研究表明，JAK3 失调与癌症和免疫疾病相关。目前主要的治疗策略包括开发高效且具有选择性的 JAK3 抑制剂 / 降解剂。

工作原理

总 JAK3 检测原理

总 JAK3 检测试剂盒可定量检测细胞裂解物中 JAK3 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 JAK3 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 JAK3 蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 JAK3 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会靠近并产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中 JAK3 蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的格式，为评估蛋白表达提供了便捷方法。

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总 JAK3 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入总 JAK3 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

phospho-how-it-works-jak3-total-assay-protocol-1.svg

总 JAK3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 JAK3 可在单一微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

siRNA 介导的 JAK3 下调实验

在 96 孔板中（每孔 200,000 个细胞），用 2.5 µM 的 Accell siRNA（Horizon 公司）特异性靶向 JAK3，或用非靶向 siRNA（作为对照）处理 HEL 细胞，每孔体系为 100 µL。在 37°C 下孵育 48 小时后，加入 50 µL 完全培养基，继续在 37°C 下孵育 24 小时。离心平板后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测抗体。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。结果显示，与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，JAK3 siRNA 处理组的信号降低了 84%，表明 JAK3 表达显著下调。

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多种人细胞系的细胞密度实验

将悬浮人细胞系 HEL、U-937 和 Jurkat 以不同细胞密度接种到 96 孔半区板中，每孔体积为 30 µL，然后用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 裂解细胞。为通过 HTRF 检测 JAK3 蛋白水平，将 16 µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，并加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测抗体。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

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HTRF 总 JAK3 检测与蛋白质印迹法的比较

在 T175 培养瓶中用完全培养基培养 U-937 细胞。在 37°C 下孵育 48 小时后，离心细胞，沉淀用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测试剂。同时，取等量裂解物用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

结果显示，使用 HTRF 总 JAK3 检测时，每孔 1,560 个细胞即可检测到显著信号；而蛋白质印迹法需要 6,250 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF 总 JAK3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

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简化通路

JAK3 信号通路

JAK3 与 JAK1 共同作用，专门与 IL-2Rγ 家族受体结合，这些受体可被 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21 激活。受体激活后，JAK3 和 JAK1 发生相互转磷酸化，进而激活转录因子 STAT1、STAT3、STAT5 和 STAT6。这些转录因子随后发生二聚化并转移至细胞核，触发调控淋巴细胞成熟、存活、激活和分化的基因转录。

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规格参数

应用领域：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症
单位规格：10,000 次检测

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货号：64JAK3TPEH

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