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HTRF JAK3 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

人总 JAK3 检测可监测细胞内 JAK3 蛋白水平。

Janus 家族激酶 JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK2 均为非受体蛋白酪氨酸激酶，它们在细胞因子受体（主要是白细胞介素受体和干扰素受体）下游传递信号，并激活 STAT 转录因子。特定的 JAK/JAK 组合与特定受体结合，为下游的 JAK/STAT 信号通路赋予特异性。JAK3 与 JAK1 结合后，仅与 IL-2Rγ 家族受体相关联，并触发转录因子 STAT1、STAT3、STAT5 和 STAT6 的激活，从而调控淋巴细胞的成熟、存活、激活和分化。

已有研究表明，JAK3 失调与癌症和免疫疾病相关。主要的治疗策略包括开发高效且具有选择性的 JAK3 抑制剂 / 降解剂。

工作原理

总 JAK3 检测原理

总 JAK3 检测可定量细胞裂解物中 JAK3 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 JAK3 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 JAK3 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质表达提供了便利。

总 JAK3 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入总 JAK3 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 JAK3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 JAK3 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

小干扰 RNA（siRNA）介导的 JAK3 下调

在 96 孔板中，每孔加入 200,000 个 HEL 细胞和 100 µL 培养液，并用 2.5 µM 的 Accell siRNA（Horizon 公司）（特异性靶向 JAK3）或非靶向 siRNA（作为对照）处理细胞。在 37°C 条件下孵育 48 小时后，加入 50 µL 完全培养基，再在 37°C 条件下孵育 24 小时。离心平板后，用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，取 16 µL 裂解物转移到白色小体积微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测抗体。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，用 JAK3 siRNA 处理的细胞中 JAK3 显著下调，信号降低了 84%。

多种人细胞系的细胞密度实验

将悬浮的人细胞系 HEL、U-937 和 Jurkat 以不同细胞密度接种到 96 孔半区板中，每孔 30 µL，并用 10 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）裂解。为通过 HTRF 检测 JAK3 蛋白水平，将 16 µL 细胞裂解物转移到白色小体积微孔板中，并加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测抗体。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 JAK3 检测与蛋白质印迹法的比较

U-937 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养。在 37°C 条件下孵育 48 小时后，离心细胞，沉淀用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移到白色小体积微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK3 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 JAK3 检测时，每孔 1560 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 6250 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 JAK3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

JAK3 信号通路

JAK3 与 JAK1 结合后，仅与 IL-2Rγ 家族受体相关联，该受体可被 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21 激活。受体激活后，JAK3 和 JAK1 相互转磷酸化，然后激活转录因子 STAT1、STAT3、STAT5 和 STAT6。这些转录因子进而二聚化并转运到细胞核中，触发调控淋巴细胞成熟、存活、激活和分化的基因转录。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64JAK3TPEY

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