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HTRF (H) IKKA P-S176/180 KIT - 500 PTS

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概述

核因子 κB 激酶亚基 α 抑制剂（IKKα）也称为 IKK1，是一种由人类 CHUK 基因编码的蛋白激酶。IKKα 是 IκB 激酶复合物（IKK）的组成部分，该复合物包含催化亚基 IKKα、IKKβ 以及调节亚基 NF-κB 必需调节因子（NEMO，即 IKKγ）。

IKK 复合物的激活依赖于 IKKβ（Ser177/180）或 IKKα（Ser176/Ser180）的磷酸化，这会导致复合物构象变化并激活激酶活性。IKKα 是 NF-κB 通路的关键调节因子，位于多种促炎因子（包括白细胞介素 - 1、肿瘤坏死因子 α（TNFα）和 toll 样受体激动剂）的下游。尽管 IKKα 和 IKKβ 高度同源，结构相似性超过 50%，但它们具有不同的下游底物和非重叠的功能。

工作原理

磷酸化 IKKα（Ser176/180）检测原理

磷酸化 IKKα（Ser176/180）检测用于测定 Ser176 和 Ser180 位点磷酸化的 IKKα。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 IKKα（Ser176/180）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 IKKα（Ser176/180）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 IKKα（Ser176/180）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IKKα（Ser176/180）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

hela 细胞中磷酸化 IKKα（Ser176/180）的激活检测

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。随后移除细胞培养基，用不同浓度的 IL1β 处理细胞，同时加入固定浓度（100 nM）的花萼海绵诱癌素 A，在含 10% 胎牛血清的细胞培养基中于 37°C、5% CO₂条件下共同孵育 15 分钟。处理后移除细胞培养基，每孔加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 IKKα 或磷酸化 IKKα（Ser176/180）检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

已有研究表明，包括 IL-1β 在内的细胞因子可激活 IKK 复合物并促进磷酸化 IKKα（Ser176/180）的磷酸化。正如预期，结果显示 IL-1β 处理后，IKKα 在 Ser176 和 Ser180 位点的磷酸化呈现明显的剂量依赖性激活，而总 IKKα 蛋白的表达水平保持恒定。

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基于磷酸化 IKKα（Ser176/180）和总 IKKα 的 HeLa 细胞抑制剂表征

将 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 5Z-7 - 氧杂 zeaenol（一种 TAK1 抑制剂）处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时。随后加入 2nM IL1β 和 100 nM 花萼海绵诱癌素 A，在细胞培养基中于 37°C、5% CO₂条件下共同孵育 15 分钟。接下来用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 IKKα 或磷酸化 IKKα（Ser176/180）检测抗体。在室温下 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，该抑制剂使 IKKα（Ser176/180）的磷酸化呈现剂量依赖性降低，而对总 IKKα 蛋白的表达水平无影响。

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磷酸化 IKKα 检测的特异性验证

使用 HTRF 人磷酸化 IKKα（Ser176/180）试剂盒，在 HAP1 细胞（野生型）以及不同的 IKKα 或 IKKβ 敲除 HAP1 细胞系中评估磷酸化 IKKα（Ser176/180）水平。预先优化细胞密度以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将不同细胞系以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时，随后用 5nM TNFα 和 100 nM 花萼海绵诱癌素 A 在 37°C、5% CO₂条件下刺激 15 分钟。然后用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合检测试剂。在室温下 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 IKKα 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 IKKα 基因完全沉默；而正如预期，在其他细胞系中可良好检测到 IKKα 水平。

值得注意的是，野生型和 IKKβ 敲除细胞系中 IKKα 的表达水平相近，这表明尽管 IKKα 和 IKKβ 的序列同源性超过 50%，HTRF IKKα 试剂盒对 IKKα 仍具有选择性。

细胞系目录参考（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 IKKα 敲除 #HZGHC000003c011；HAP1 IKKβ 敲除 #HZGHC023808c011

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HTRF 磷酸化 IKKα p-S176/180 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，先用 2nM IL1β 和 100 nM 花萼海绵诱癌素 A 在 37°C、5% CO₂条件下刺激细胞 15 分钟，然后用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 磷酸化 IKKα（Ser176/180）检测试剂。取等量裂解物用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

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简化通路

IKKα 信号通路

NF-κB 通路参与免疫应答、细胞生长和凋亡的调控。这些通路可通过经典通路或替代通路激活。经典通路的激活会刺激包括 TAK1 在内的不同激酶，TAK1 通过磷酸化 IKKβ（Ser177/Ser181）或 IKKα（Ser176/Ser180）亚基激活 IκB 激酶复合物（IKK）。受刺激后，IKK 复合物磷酸化 IκBα，使 p50-p65 能够转移至细胞核。替代通路的激活会导致 NIK 激活，进而磷酸化 IKKα 亚基。

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规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 次检测

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货号：64KKAS6PEG

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