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HTRF IKKB P-S177/181 KIT - 500 PTS

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概述

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测试剂盒可直接在完整细胞中检测活化 IKK-β 的 Ser177/181 位点磷酸化水平。该试剂盒采用简化实验流程，适用于小体积反应体系，可从基础研究扩展至高通量药物筛选。

工作原理

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测原理

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测通过特异性检测 Ser177/181 位点磷酸化的 IKK-β 发挥作用。与蛋白质印迹（Western Blot）不同，该检测为全板式实验，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测过程中使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可识别蛋白质本身（不受其磷酸化状态影响）。当蛋白质发生磷酸化时，两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接相关，且该检测为 “无需洗涤” 格式，可直接评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 IKK-β（Ser177/181）双板检测 protocol

双板实验流程包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 IKK-β（Ser177/181）HTRF 检测试剂。该流程可实时监测细胞活力和汇合度。

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磷酸化 IKK-β（Ser177/181）单板检测 protocol

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IKK-β（Ser177/181）可在单一培养板中完成，该板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）优化流程支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

HTRF 磷酸化 IKK-β 检测与蛋白质印迹的比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天，用 0.5nM IL-1β 刺激 15 分钟。去除培养基后，加入 3mL 补充裂解缓冲液并孵育 45 分钟，10 分钟离心后收集可溶性上清。取等量裂解液进行蛋白质印迹与 HTRF 检测的平行比较。结果显示，HTRF 检测灵敏度更高：HTRF 仅需 12,000 个细胞，而蛋白质印迹需 46,000 个细胞。

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TNF-α 对 HeLa 细胞的剂量反应

将两种浓度的 HeLa 细胞（100K 和 200K 细胞 / 孔）与不同浓度的 TNF-α 在 37°C 下孵育 15 分钟，裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测流程测定磷酸化 IKK-β 水平。

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IL-1β 对 HeLa 细胞的剂量反应

将两种浓度的 HeLa 细胞（100K 和 200K 细胞 / 孔）与不同浓度的 IL-1β 在 37°C 下孵育 15 分钟，裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测流程测定磷酸化 IKK-β 水平。

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HeLa 细胞中磷酸化与总 IKK-β 的检测

将不同密度（200K 和 100K）的 HeLa 细胞接种于 96 孔板（每孔 100µL）并孵育过夜。吸去培养基后，加入 50µL 不同浓度的 IL-1β 孵育 15 分钟。孵育结束后吸去培养基，加入 50µL 1X 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16µL 裂解液转移至 384 孔白色微量检测板，加入 4µL HTRF 磷酸化 IKK-β（Ser177/181）或总 IKK-β 检测试剂，室温孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。

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简化通路

IKK-β 简化通路

NF-κB 的激活始于信号诱导的 IκB 蛋白降解，这一过程主要通过 IκB 激酶（IKK）的活化实现。IKK 由 3 个亚基组成异源三聚体：IKK-α 和 IKK-β（两个催化亚基）以及 IKK-γ/NEMO（调节亚基）。活化的 IKK-β 可磷酸化 NF-κB 抑制蛋白 IκB（如 IκBα），而 IκB 通常通过结合 NF-κB 抑制其功能。磷酸化的 IκB 通过泛素化途径降解，释放 NF-κB 使其进入细胞核，激活参与炎症及其他免疫反应的多种基因。此外，IKK-β 在中风后的脑细胞中发挥重要作用。

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规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：TR-FRET
治疗领域：传染病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、神经科学、肿瘤与炎症
单位规格：500 次检测反应

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货号：64KKBPEG

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