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HTRF IKKB P-S177/181 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测可直接在完整细胞中检测活化的 IKK-β 的 Ser177/181 磷酸化。该试剂盒采用简化的实验方案，适用于小体积格式，可用于从基础研究到高通量药物筛选等多种场景。

工作原理
磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测原理
磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测用于测量在 Ser177/181 位点发生磷酸化的 IKK-β。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，最后加入磷酸化 IKK-β（Ser177/181）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IKK-β（Ser177/181）时，可在同一微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解步骤。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证
HTRF 磷酸化 IKK-β 检测与蛋白质印迹法的比较
将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天。用 0.5nM 的白细胞介素 1β（IL1β）刺激细胞 15 分钟。去除细胞培养液后，加入 3mL 补充的裂解缓冲液，孵育 45 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量的裂解液，对蛋白质印迹法和 HTRF 检测进行平行比较。结果显示，HTRF 检测的灵敏度高于蛋白质印迹法：HTRF 检测仅需 12,000 个细胞，而蛋白质印迹法需要 46,000 个细胞。

肿瘤坏死因子 α（TNFα）对 HeLa 细胞的剂量反应
将两种浓度的 HeLa 细胞（100,000 和 200,000 个细胞 / 孔）与不同浓度的肿瘤坏死因子 α（TNFα）在 37°C 下孵育 15 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化 IKK-β 的水平。

白细胞介素 1β（IL1β）对 HeLa 细胞的剂量反应
将两种浓度的 HeLa 细胞（100,000 和 200,000 个细胞 / 孔）与不同浓度的白细胞介素 1β（IL1β）在 37°C 下孵育 15 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化 IKK-β 的水平。

HeLa 细胞中磷酸化 IKK-β 和总 IKK-β 的检测
将不同密度（200,000 和 100,000 个细胞 / 孔）的 HeLa 细胞接种到 96 孔板中，每孔 100µL，过夜孵育。吸去培养液，加入 50µL 不同浓度的 IL-1β，孵育 15 分钟。孵育后，吸去培养液，加入 50µL 1X 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。将 16µL 裂解液转移至 384 孔白色小体积微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 IKK-β（Ser177/181）或总 IKK-β 检测试剂。在室温下孵育 2 小时后，记录 HTRF 信号。

简化通路
IKK-β 简化通路
核因子 κB（NF-κB）的激活始于信号诱导的 κB 抑制蛋白（IκB）降解。这一过程主要通过一种名为 IκB 激酶（IKK）的激酶活化来实现。IKK 由三个亚基组成异源三聚体，包括 IKK-α 和 IKK-β（两个催化亚基）以及 IKK-γ/NEMO（一个调节亚基）。活化的 IKK-β 会磷酸化 NF-κB 抑制蛋白（IκB，如 IκBα），而 IκB 原本与 NF-κB 结合并抑制其功能。磷酸化的 IκB 会通过泛素化途径降解，使 NF-κB 得以释放并进入细胞核，从而激活参与炎症和其他免疫反应的多种基因。在中风后的脑细胞中，IKK-β 发挥着重要作用。

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、代谢疾病 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64KKBPEY

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