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HTRF MLKL P-S358 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法能够便捷且准确地检测 Ser358 位点磷酸化的 MLKL。

MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）是凋亡性和坏死性细胞死亡以及 TNFR1 和其他受体下游炎症通路的关键介质。MLKL 的丝氨酸 358 位点会被 RIPK3 磷酸化，被视为 RIPK1/RIPK3 依赖性坏死性凋亡启动的生物标志物。

坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡通路，也称为 “炎症性细胞死亡”，与包括炎症性疾病、神经退行性疾病以及癌症在内的多种病症密切相关。因此，MLKL 已成为制药行业的重要药物靶点。治疗策略包括开发特定的小分子激酶抑制剂，如知名的 Necrostatin-1 和 Necrostatin-1s。

工作原理

磷酸化 MLKL（Ser358）检测原理

磷酸化 MLKL（Ser358）检测用于测量在 Ser358 位点发生磷酸化的 MLKL。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了途径。

磷酸化 MLKL（Ser358）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入磷酸化 MLKL（Ser358）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 MLKL（Ser358）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 MLKL（Ser358）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

磷酸化 MLKL（Ser358）单板检测方案示意图

检测验证

肿瘤坏死因子 α（TNFα）刺激 HT-29 细胞中 MLKL 的激活

将人结直肠癌细胞系 HT-29 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在 MLKL 激活实验中，先用 25µM Z-VAD（泛半胱天冬酶抑制剂）预处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM SM-164（cIAP1/2 抑制剂）和不同浓度的人肿瘤坏死因子 -α（TNF-α），处理 6 小时。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。检测步骤中，将 16µL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）或总 MLKL 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在存在分别阻断细胞存活和凋亡的 SM-164 和 Z-VAD 的情况下，TNF-α 诱导 MLKL 在 Ser358 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，这凸显了坏死性凋亡通路的激活。总 MLKL 的信号水平未发生变化，表明在磷酸化 MLKL 上观察到的变化是由药物处理引起的，而非坏死性凋亡晚期可能发生的细胞脱落所致。

使用坏死性凋亡抑制剂防止 HT-29 细胞中坏死性凋亡的激活

将人结直肠癌细胞系 HT-29 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25µM Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，然后加入不同剂量的 Necrostatin-1s 或 Necrostatin-1。再过 10 分钟后，加入含 100ng/mL TNF-α 和 100nM SM-164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。检测时，将 16µL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）或总 MLKL 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1 及其类似物 Necrostatin-1s 均诱导 MLKL 在 Ser358 位点的磷酸化呈剂量依赖性降低，而总 MLKL 保持稳定。正如预期，基于磷酸化 MLKL 的半数抑制浓度（IC50）值，Necrostatin-1s 比原小分子药物的效力更高，约为 Necrostatin-1 的 2 倍。

HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）检测与蛋白质印迹法的比较

将人结直肠癌细胞系 HT-29 在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。先用 25µM Z-VAD 预处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM SM-164 和 100ng/mL 人 TNF-α，处理 6 小时。处理后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MLKL（Ser166）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）检测时，每孔 8,125 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法获得最小化学发光信号则需要 65,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 MLKL 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

MLKL 信号通路

MLKL 在肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）诱导的坏死性凋亡（一种程序性细胞死亡过程）中发挥关键作用。

当 TNF-α 与 TNFR1 结合后，该受体通过招募多种蛋白质（包括 RIPK1、TRADD、TRAF2 以及细胞凋亡抑制因子 1 和 2（cIAP1/2）），触发细胞质膜上复合物 I 的快速形成。cIAP1/2 催化 RIPK1 的多泛素化，进而招募 IKKα 和 IKKβ，并激活 NF-κB 促存活通路。

在缺乏 cIAP1/2 的情况下，RIPK1 从 TNFR1 释放出来，与 FADD 和半胱天冬酶 8 结合形成胞质复合物 IIa，该复合物负责半胱天冬酶 8 依赖性细胞凋亡。

当半胱天冬酶 8 活性受到抑制或在病理条件下，MLKL 与 RIPK1 和 RIPK3 相互作用，形成胞质复合物 IIb（也称为 “坏死小体”），该复合物参与坏死性凋亡的启动。在 RIPK1 自身磷酸化后，MLKL 被 RIPK3 在 Ser358 位点磷酸化，导致其寡聚化、定位到质膜，并引发以钙内流和质膜损伤为特征的程序性坏死。随后，损伤相关分子模式（DAMPs）被释放，以促进损伤修复。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64MLKLS8PEY

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