总 MLKL 细胞检测可监测总 MLKL 水平，且能与磷酸化 MLKL（Ser358）试剂盒配合用作归一化检测。该试剂盒与磷酸化 MLKL 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白群体和总蛋白群体。

MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）是凋亡性和坏死性细胞死亡的关键介质，也是肿瘤坏死因子受体 1（TNFR1）及其他受体下游炎症通路的重要调控因子。MLKL 的丝氨酸 358 位点可被受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3）磷酸化，该位点的磷酸化被视为 RIPK1/RIPK3 依赖性坏死性凋亡启动的生物标志物。

坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡通路，也被称为 “炎症性细胞死亡”，与炎症性疾病、神经退行性疾病及癌症等多种病理状态密切相关。因此，MLKL 已成为制药行业的重要药物靶点。相关治疗策略包括开发特异性小分子激酶抑制剂，如知名的 Necrostatin-1 和 Necrostatin-1s。

HTRF 总 MLKL 检测可定量细胞裂解物中 MLKL 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 MLKL 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 MLKL 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达水平。

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双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 MLKL HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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使用 HTRF 试剂检测总 MLKL 可在单个用于培养、刺激和裂解的微孔板中进行，无需洗涤步骤。这种专为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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将人结直肠癌细胞系 HT-29 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在 MLKL 激活实验中，先用 25 µM Z-VAD（泛半胱天冬酶抑制剂）预处理细胞 30 分钟，随后同时加入 100 nM SM-164（cIAP1/2 抑制剂）和不同浓度的人 TNF-α，处理 6 小时。处理后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）或总 MLKL 检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在分别阻断细胞存活和凋亡的 SM-164 与 Z-VAD 共同作用下，TNF-α 可诱导 MLKL 的 Ser358 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，表明坏死性凋亡通路被激活。总 MLKL 的信号水平未发生变化，这说明磷酸化 MLKL 的变化是由药物处理引起的，而非坏死性凋亡晚期可能发生的细胞脱落所致。

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将人结直肠癌细胞系 HT-29 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25 µM Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，随后加入不同剂量的 Necrostatin-1s 或 Necrostatin-1。10 分钟后，加入含 100 ng/mL TNF-α 和 100 nM SM-164 的混合液，处理 6 小时。处理后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 MLKL（Ser358）或总 MLKL 检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1 及其类似物 Necrostatin-1s 均能诱导 MLKL 的 Ser358 位点磷酸化呈剂量依赖性降低，而总 MLKL 水平保持稳定。正如预期，基于磷酸化 MLKL 的半数抑制浓度（IC50）值，Necrostatin-1s 的效力约为 Necrostatin-1 的 2 倍，比原始小分子更有效。

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将人结直肠癌细胞系 HT-29 在 T175 培养瓶中使用完全培养基培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。先用 25 µM Z-VAD 预处理细胞 30 分钟，随后同时加入 100 nM SM-164 和 100 ng/mL 人 TNF-α，处理 6 小时。处理后，加入 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 MLKL 检测试剂。取等量裂解物通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。

使用 HTRF 总 MLKL 检测时，4,100 个细胞 / 孔即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需 8,125 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF 总 MLKL 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

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MLKL 在肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）诱导的坏死性凋亡（一种程序性细胞死亡过程）中发挥关键作用。

当 TNF-α 与 TNFR1 结合后，受体通过招募多种蛋白（包括 RIPK1、TRADD、TRAF2 以及细胞凋亡抑制因子 1 和 2（cIAP1/2））在细胞质膜上快速形成复合物 I。cIAP1/2 催化 RIPK1 的多泛素化，进而招募 IKKα 和 IKKβ 并激活 NF-κB 促存活通路。

在缺乏 cIAP1/2 的情况下，RIPK1 从 TNFR1 释放，与 FADD 和半胱天冬酶 8 结合形成胞质复合物 IIa，介导半胱天冬酶 8 依赖性细胞凋亡。

当半胱天冬酶 8 活性受抑制或在病理条件下，MLKL 与 RIPK1 和 RIPK3 相互作用形成胞质复合物 IIb（也称为 “坏死小体”），启动坏死性凋亡。RIPK1 自磷酸化后，RIPK3 将 MLKL 的 Ser358 位点磷酸化，促使 MLKL 寡聚化、定位到质膜并执行程序性坏死（表现为钙内流和质膜损伤）。随后，损伤相关分子模式（DAMPs）释放以促进损伤修复。

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