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HTRF STING P-S365 (M) KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷且准确地定量小鼠 Ser365 位点磷酸化的 STING。在病原体感染以及双链 DNA（dsDNA）与胞质传感器 cGAS 结合后，STING 蛋白会被 TBK1 磷酸化。这使其能够与 IRF3 结合，进而诱导 1 型干扰素的产生及其他免疫反应。随后，STING 通路会通过自噬相关的 STING 降解而关闭。

工作原理

小鼠磷酸化 STING（Ser365）检测原理

小鼠磷酸化 STING（Ser365）检测用于测量小鼠 Ser365 位点磷酸化的 STING。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。小鼠磷酸化 STING（Ser365）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了途径。

小鼠磷酸化 STING（Ser365）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移至小体积检测板（HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）中，之后加入 HTRF 小鼠磷酸化 STING（Ser365）检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

小鼠磷酸化 STING（Ser365）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测小鼠磷酸化 STING（Ser365）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

DMXAA 诱导 RAW 264.7 和 NIH3T3 细胞中小鼠 STING 的磷酸化

将 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞以 50µL 的量接种到 96 孔板中（分别为 200,000 个细胞 / 孔和 100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，过夜孵育。用不同浓度的小鼠特异性配体 DMXAA（50µL，处理 1 小时）刺激细胞。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化小鼠 STING 或总小鼠 STING 检测抗体。最后，在室温下孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。DMXAA 显著激活了 STING 通路，使 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞中 STING 的磷酸化水平分别提高了 8 倍和 6 倍。

ADU-S100 诱导 RAW 264.7 和 NIH3T3 细胞中小鼠 STING 的磷酸化

将 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞以 50µL 的量接种到 96 孔板中（分别为 200,000 个细胞 / 孔和 100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，过夜孵育。用不同浓度的环二腺苷酸（c-di-AMP）类似物 ADU-S100（50µL，处理 1 小时）刺激细胞。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化小鼠 STING 或总小鼠 STING 检测抗体。最后，在室温下孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。ADU-S100 显著激活了 STING 通路，使 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞中 STING 的磷酸化水平分别提高了 9 倍和 5 倍。STING 磷酸化水平的升高伴随着其表达水平的下调，这与自噬介导的降解一致。

3'3' 环磷酸鸟苷 - 腺苷（3'3'cGAMP）诱导 RAW264.7 细胞中小鼠 STING 的磷酸化

将 RAW264.7 细胞以 50µL 的量接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，过夜孵育。用不同浓度的细菌环二核苷酸配体 3'3'cGAMP（50µL，处理 1 小时）刺激细胞。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化小鼠 STING 或总小鼠 STING 检测抗体。最后，在室温下孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。3'3'cGAMP 显著激活了 STING 通路，使 STING 的磷酸化水平提高了 5 倍。

2'3' 环磷酸鸟苷 - 腺苷（2'3'cGAMP）诱导 RAW264.7 细胞中小鼠 STING 的磷酸化

将 RAW264.7 细胞以 50µL 的量接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，过夜孵育。用不同浓度的非经典 cGAMP（2'3'cGAMP，50µL，处理 1 小时）刺激细胞。处理后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化小鼠 STING 或总小鼠 STING 检测抗体。最后，在室温下孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。3'3'cGAMP 显著激活了 STING 通路，使 STING 的磷酸化水平提高了 4 倍。STING 磷酸化水平的升高伴随着其表达水平的下调，这与自噬介导的降解一致，而在相同条件下 α- 微管蛋白保持稳定。

HTRF 小鼠磷酸化 STING 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将 RAW264.7 细胞系接种到含完全培养基的 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天。然后用 100µM DMXAA 刺激细胞 1 小时，并用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 小鼠磷酸化 STING 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，在这些实验条件下，两种技术的灵敏度相同。

简化通路

STING 简化通路

STING，即干扰素基因刺激因子，是一种定位于内质网的胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥重要作用。在病原体感染或细胞凋亡过程中线粒体收缩时，游离的双链 DNA 会结合并激活 DNA 传感器 —— 环 GMP-AMP 合成酶（cGAS）。激活的 cGAS 会促使 2'3'cGAMP（一种环二核苷酸）的产生，随后 2'3'cGAMP 与 STING 蛋白结合。进而，磷酸化的 STING 与 TANK 结合激酶 1（TBK1）相互作用，招募并激活活性干扰素调节因子（IRF3）二聚体。IRF3 二聚体进入细胞核后，会诱导编码干扰素 -α/β 的基因转录。此外，STING 通路还调控 NF-κB 依赖性炎症细胞因子的表达。作为负反馈循环，DNA 刺激的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62 SQSTM1 相关的自噬触发 STING 蛋白的降解，从而关闭干扰素 β 的产生。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64MSTGPEY

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