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HTRF P62/SQSTM1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷且准确地监测 p62/SQSTM1 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它使用与我们的磷酸化 p62/SQSTM1 试剂盒相同的缓冲液，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，作为自噬通路的关键读数指标。自噬是一种细胞机制，可清除异常蛋白或细胞器，在癌症、神经退行性疾病以及心血管和感染性疾病中发挥作用。

p62/SQSTM1 是一种泛素结合蛋白，充当多泛素化 cargo 蛋白与自噬体之间的桥梁。p62 直接与 cargo 蛋白以及参与自噬体形成的 LC3 蛋白相互作用。最终，激活的自噬通路促进 p62 相关的泛素化蛋白 cargo 的降解。

工作原理

总 p62/SQSTM1 检测原理

总 p62/SQSTM1 检测可定量细胞裂解物中 p62 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 p62/SQSTM1 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 p62/SQSTM1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样本中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质表达的方法。

总 p62/SQSTM1 双板检测方案

双板方案包括在裂解前将细胞培养在 96 孔板中，然后将裂解物转移到小体积检测板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，再添加 HTRF 总 p62/SQSTM1 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 p62/SQSTM1（Ser403）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 p62/SQSTM1 可在用于培养、刺激和裂解的单个板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

未处理细胞中 p62/SQSTM1 的表达及其 Ser403 位点的磷酸化

将人 HeLa 细胞、SH-SY5Y 细胞和小鼠 Neuro2a 细胞分别以 100,000、120,000 和 50,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中。

在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，弃去细胞培养基，加入 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）。

在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按如下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，随后加入 12µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示，在评估的未处理细胞系中均检测到 p62/SQSTM1 的表达，但仅在 Neuro2A 细胞中其磷酸化水平升高。

这些结果除了证明两种检测方法与人和小鼠样本的兼容性外，还表明 p62/SQSTM1 的行为因细胞背景而异。

巴弗洛霉素 A1 剂量反应

将人 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以 100,000 和 120,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

用递增浓度的巴弗洛霉素 A1（一种公认的自噬流阻断剂）孵育过夜后，移除细胞培养基，用 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按如下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，随后加入 12µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，巴弗洛霉素 A1 浓度的增加与 p62/SQSTM1 的表达及其 S403 位点磷酸化的剂量依赖性增加相关。

注意，巴弗洛霉素的半数有效浓度（EC50）约为 20nM，且在 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞中相当。

HeLa 细胞饥饿 6 小时实验

将人 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中。孵育 24 小时后，移除细胞培养基，更换为 EBSS（一种缺乏氨基酸和维生素的培养基）或新鲜培养基，持续 6 小时。

接下来，用 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按如下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，随后加入 12µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，氨基酸缺乏条件下总 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬诱导的降解机制导致的。

PP242 剂量反应

将人 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以 100,000 和 120,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中。

用递增浓度的自噬诱导剂 PP242 处理细胞（HeLa 细胞：6 小时；SH-SY5Y 细胞：过夜）后，移除培养基。

接下来，用 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按如下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，随后加入 12µL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，PP242 处理后 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬通路诱导的降解导致的。

HTRF 总 p62/SQSTM1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

人 HeLa 细胞培养 2 天，直至达到 80% 汇合度。然后用 MG-132（4µM）刺激细胞过夜，之后用补充的裂解缓冲液裂解，通过离心收集可溶性上清液。

将细胞裂解物在补充的 #4 裂解缓冲液（1X）中进行系列稀释，将 16µL 裂解物转移到 HTRF 小体积检测微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 p62/SQSTM1 检测试剂。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

p62/SQSTM1 检测相关简化通路

自噬是一种生理性细胞过程，可清除错误折叠或聚集的蛋白质以及受损的细胞器（如线粒体，也称为线粒体自噬）。自噬通路在氧化应激、营养缺乏、感染（异体自噬）时被激活，也在癌症或神经退行性疾病发展过程中被激活，其依赖于关键分子，如 p62/SQSTM1、ATG 蛋白或 LC3。

p62/SQSTM1 是一种衔接蛋白，首先被 ULK1 在丝氨酸 407 位点磷酸化，然后被酪蛋白激酶 2 或 TBK1 在丝氨酸 403 位点磷酸化。Ser403 位点的磷酸化增加了其与泛素链的亲和力，从而使 p62/SQSTM1 能够结合泛素化的 cargo 蛋白。与 p62/SQSTM1 蛋白相关的泛素化蛋白或泛素包被的线粒体被吞噬体摄取，吞噬体内容物在与溶酶体融合后被清除。

此外，已有报道称在氧化应激或氨基酸缺乏时，p62/SQSTM1 的 Ser349 位点会发生磷酸化。这种磷酸化事件会破坏 Keap1 与转录因子 Nrf2 之间的相互作用，使 Nrf2 转移到细胞核中，激活包括 p62/SQSTM1 在内的抗氧化基因的转录。同时，细胞质中的 Keap1 被 p62/SQSTM1 捕获，并通过自噬清除被降解。

除了 p62/SQSTM1 在将不需要的 cargo 导向自噬清除中的作用外，其他成分在自噬过程中也至关重要。其中包括 ULK1 和 VSP34 复合物，以及由 ATG 蛋白家族和 LC3-II 组成的共轭机制，它们依次参与吞噬泡的形成。吞噬泡逐渐形成自噬体，自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其中蛋白酶或磷酸酶等酶具有活性。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 裂解缓冲液 1
- 裂解缓冲液 4
- 裂解缓冲液 5
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样本体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：
- 人
- 小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：
- 心血管疾病
- 感染性疾病
- 神经科学
- 肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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