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HTRF P62/SQSTM1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法能够便捷且准确地监测 p62/SQSTM1 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它与我们的磷酸化 p62/SQSTM1 试剂盒使用相同的缓冲液，可从单个样品中分析磷酸化蛋白和总蛋白，作为自噬通路的关键读数。自噬是一种能够清除异常蛋白质或细胞器的细胞机制，在癌症、神经退行性疾病以及心血管和感染性疾病中发挥作用。

HeLa 细胞饥饿 6 小时

将人 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。孵育 24 小时后，移除细胞培养基，更换为 EBSS（一种不含氨基酸和维生素的培养基）或新鲜培养基，处理 6 小时。

接下来，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，氨基酸缺乏条件下总 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬诱导的降解机制导致的。

PP242 剂量反应

将人 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以 100,000 和 120,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。

用不同浓度的自噬诱导剂 PP242 处理细胞（HeLa 细胞：6 小时；SH-SY5Y 细胞：过夜）后，移除培养基。

接下来，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）。
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1。

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，PP242 处理后 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬通路诱导的降解导致的。

HTRF 总 p62/SQSTM1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HeLa 细胞培养 2 天，直至达到 80% 汇合度。然后用 MG-132（4µM）刺激细胞过夜，之后用补充的裂解缓冲液裂解，通过离心收集可溶性上清液。

用补充的 4 号裂解缓冲液（1X）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 裂解物转移到 HTRF 小体积检测微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 p62/SQSTM1 检测试剂。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

p62/SQSTM1 检测的简化通路

自噬是一种生理性细胞过程，能够清除错误折叠或聚集的蛋白质以及受损的细胞器（如线粒体，也称为线粒体自噬）。自噬通路在氧化应激、营养缺乏、感染（异源自噬）时被激活，也会在癌症或神经退行性疾病发生发展过程中被激活，其依赖于 p62/SQSTM1、ATG 蛋白或 LC3 等关键分子。

p62/SQSTM1 是一种衔接蛋白，首先被 ULK1 在丝氨酸 407 位点磷酸化，然后被酪蛋白激酶 2 或 TBK1 在丝氨酸 403 位点磷酸化。Ser403 位点的磷酸化会增加其对泛素链的亲和力，从而使 p62/SQSTM1 能够结合泛素化的货物蛋白。与 p62/SQSTM1 相关的泛素化蛋白或泛素包被的线粒体被带入吞噬体，吞噬体内容物在与溶酶体融合后被清除。

此外，已有报道称，在氧化应激或氨基酸缺乏时，p62/SQSTM1 的丝氨酸 349 位点会发生磷酸化。这种磷酸化事件会破坏 Keap1 与转录因子 Nrf2 之间的相互作用，使 Nrf2 进入细胞核，激活包括 p62/SQSTM1 在内的抗氧化基因的转录。同时，细胞质中的 Keap1 被 p62/SQSTM1 捕获，并通过自噬清除被降解。

除了 p62/SQSTM1 在将不需要的货物导向自噬清除中的作用外，自噬过程还需要其他成分。其中包括 ULK1 和 VSP34 复合物，以及由 ATG 蛋白家族和 LC3-II 组成的共轭机制，它们依次参与吞噬泡的形成。吞噬泡逐渐形成自噬体，自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其中蛋白酶或磷酸酶等酶具有活性。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管、感染性疾病、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64N62PEY

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