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HTRF ACC TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）是脂肪酸代谢的重要调节因子。通过催化乙酰辅酶 A 羧化为丙二酰辅酶 A，ACC 在糖尿病和肥胖症研究中成为一种新型生物标志物或药物靶点。ACC 的酶活性可被丝氨酸 79（Ser-79）残基的磷酸化抑制。

与参与脂肪酸调节的多种基因类似，ACC 基因的转录受 SREBP1c 转录因子的严格调控。该转录因子激活后，会与 ACC 基因启动子上游的 SRE DNA 序列结合，从而激活其转录。因此，对总 ACC 的定量检测可作为 SREBP1c 通路激活的重要读数指标。

HTRF 总 ACC 细胞检测可监测 ACC1 和 ACC2 的表达水平，并可与 HTRF 磷酸化 ACC Ser79 检测试剂盒配合作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 ACC 检测试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

这种基于细胞的检测方法能够简单、灵敏且高效地定量 ACC1/2，相比 ELISA 或 WB 检测具有更高的便利性。

工作原理

总 ACC 检测原理

总 ACC 检测可对细胞裂解物中 ACC 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 ACC 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ACC 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

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总 ACC 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 ACC HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

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总 ACC 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ACC 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

HTRF 总 ACC 是 SREBP1c 通路的有效读数指标

T0901317 是一种合成的 LXR 核受体激动剂，可刺激 SREBP-1c 转录。激活的 SREBP1c 转录因子与 ACC 基因启动子上游的 SRE DNA 序列结合，激活其转录。因此，总 ACC 的定量检测是 SREBP1c 通路激活的重要读数指标。

将 75,000 个人类 HepG2 细胞接种到 96 孔板中，使用 DMEM 培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 10µM T0901317 刺激细胞 4 小时或 48 小时，然后移除培养基，加入 50µL 裂解缓冲液 4，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16µL 裂解物分别通过 HTRF 磷酸化 ACC（Ser79）检测和总 ACC 检测进行分析，另取 4µL 通过 HTRF α- 微管蛋白检测进行归一化。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号，归一化微管蛋白的计算方法为：磷酸化 ACC（Ser79）的 HTRF 比值或总 ACC 的 HTRF 比值除以 α- 微管蛋白的 HTRF 比值再乘以 100。

通过经 α- 微管蛋白归一化的结果（处理组与未处理组对比）分析 T0901317 的作用。

assay-validation-acc-total-1

总 ACC 与磷酸化 ACC 试剂盒在经多索莫林处理的人类 HepG2 细胞系中的联合应用

将 100,000 个人类 HepG2 细胞接种到 96 孔板中，使用完全 DMEM 培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。在无血清 DMEM 培养基中用不同浓度的多索莫林刺激细胞 2 小时，然后加入 50µL 裂解缓冲液 4，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。将 16µL 裂解物转移至 384 孔白色微量检测板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 ACC（Ser79）或总 ACC 检测试剂。overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

assay-validation-acc-total-2

人类 HepG2 细胞系经 T0901317（10µM）刺激后的 HTRF 总 ACC 检测与蛋白质印迹法对比

将人类 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全 DMEM 培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 10µM T0901317 刺激细胞 16 小时，移除培养基后加入 3mL 裂解缓冲液 4，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移至 384 孔白色微量检测板中，然后加入 4µL HTRF 总 ACC 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行对比分析。

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简化通路

脂肪酸代谢中的乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）

乙酰辅酶 A 羧化酶在哺乳动物中存在两种亚型 ——ACC-1 和 ACC-2（或 ACC-α 和 ACC-β），它们是普遍存在的关键酶，对细胞能量代谢至关重要。ACC-1 负责依赖 ATP 的乙酰辅酶 A 羧化为丙二酰辅酶 A 的反应，而 ACC-2 催化的丙二酰辅酶 A 羧化则专门与线粒体 β- 脂肪酸氧化相关。ACC-1 和 ACC-2 是脂肪酸生物合成和氧化的关键调节因子，因此成为 2 型糖尿病、代谢综合征、心脏病乃至癌症药物设计的潜在靶点。

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规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 裂解缓冲液 4
- 裂解缓冲液 5
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：
- 人类
- 小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：
- 代谢 / 糖尿病
- 非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：10,000 个检测点

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