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HTRF ACC TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

ACC（乙酰辅酶 A 羧化酶）是脂肪酸代谢的重要调节因子。通过催化乙酰辅酶 A 羧化为丙二酰辅酶 A，ACC 在糖尿病和肥胖症研究中可作为一种新型生物标志物或药物靶点。ACC 的酶活性会因 Ser-79 残基的磷酸化而受到抑制。

与多种参与脂肪酸调节的基因一样，ACC 基因的转录受到 SREBP1c 转录因子的严格调控。该转录因子激活后，会与 ACC 基因启动子上游的 SRE DNA 序列结合，并激活其转录。因此，对总 ACC 的定量检测可作为 SREBP1c 通路激活的一个有价值的读数。

HTRF 总 ACC 细胞检测可监测 ACC1 和 ACC2 的表达水平，并可与 HTRF 磷酸化 ACC Ser79 试剂盒配合作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 ACC 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白。

这种基于细胞的检测方法能够简单、灵敏且高效地对 ACC1/2 进行定量，相比 ELISA 或 WB 检测更为便捷。

工作原理

总 ACC 检测原理

总 ACC 检测用于定量细胞裂解物中 ACC 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 ACC 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ACC 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达。

总 ACC 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加总 ACC HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 ACC 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ACC 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

HTRF 总 ACC 是 SREBP1c 通路的相关读数

T0901317 是一种合成的 LXR 核受体激动剂，可刺激 SREBP-1c 的转录。激活的 SREBP1c 转录因子与 ACC 基因启动子上游的 SRE DNA 序列结合，并激活其转录。因此，对总 ACC 的定量检测可作为 SREBP1c 通路激活的一个有价值的读数。

将 75,000 个人类 HepG2 细胞接种到 96 孔板中，使用 DMEM 培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 10µM 的 T0901317 刺激细胞 4 小时或 48 小时。然后移除培养基，用 50µL 的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。取 16µL 裂解物分别用 HTRF 磷酸化 ACC（Ser79）和总 ACC 检测，取 4µL 用 HTRFα- 微管蛋白检测以进行归一化。孵育过夜后记录 HTRF 信号。归一化微管蛋白的计算方法为：磷酸化 ACC（Ser79）的 HTRF 比值或总 ACC 的 HTRF 比值除以 α- 微管蛋白的 HTRF 比值再乘以 100。

使用经 α- 微管蛋白归一化的结果（处理组与未处理组）分析 T0901317 的作用。

总 ACC 与磷酸化 ACC 试剂盒在经多索莫林处理的人类 HepG2 细胞系中的配合使用

将 100,000 个人类 HepG2 细胞接种到 96 孔板中，使用完全 DMEM 培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。在无血清 DMEM 培养基中，用不同浓度的多索莫林刺激细胞 2 小时。用 50µL 的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4µL 的 HTRF 磷酸化 ACC（Ser79）或总 ACC 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

人类 HepG2 细胞系经 10µM T0901317 刺激后的 HTRF 总 ACC 检测与蛋白质印迹法比较

将人类 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全 DMEM 培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 10µM 的 T0901317 刺激细胞 16 小时。移除培养基，然后用 3mL 的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4µL 的 HTRF 总 ACC 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

简化通路

脂肪酸代谢中的乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）

乙酰辅酶 A 羧化酶有两种哺乳动物同工酶，即 ACC-1 和 ACC-2（或 ACC-α 和 ACC-β），它们是普遍存在的关键酶，对细胞能量代谢至关重要。ACC-1 负责依赖 ATP 的乙酰辅酶 A 羧化为丙二酰辅酶 A，而 ACC-2 催化的丙二酰辅酶 A 羧化则专门与线粒体 β- 脂肪酸氧化相关。ACC-1 和 ACC-2 是脂肪酸生物合成和氧化的关键调节因子，因此成为 2 型糖尿病、代谢综合征、心脏病甚至癌症药物设计中极具吸引力的靶点。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样本体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NACPEY

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