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HTRF FAK TOTAL KIT - 500 PTS 总FAK试剂盒 - 500测试

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概述

总 FAK 细胞检测可监测总 FAK 的表达水平，并可与磷酸化 FAK 检测试剂盒配合使用作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 FAK 检测试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

黏着斑激酶（FAK）是一种胞质酪氨酸激酶，调控细胞黏附、迁移、增殖和存活。FAK 是细胞外基质（ECM）/ 整合素和钙黏蛋白信号通路的核心调节因子，在细胞黏附、细胞连接、迁移、存活和机械感知中发挥作用。FAK 可被生长因子受体、细胞因子受体和 G 蛋白偶联受体（GPCRs）激活。在多种癌症中，FAK 表达和磷酸化水平的升高与肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭能力增强相关；在组织纤维化中，与成纤维细胞在纤连蛋白上的迁移相关。

工作原理

总 FAK 检测原理

总 FAK 检测可定量细胞裂解物中 FAK 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 FAK 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FAK 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且可在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达水平。

Phospho how it works total FAK assay principle

总 FAK 双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 FAK HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Phospho how it works total FAK 2 plate assay protocol

总 FAK 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 FAK 可在单个用于培养、刺激和裂解的微孔板中进行，无需洗涤步骤。这种专为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

Phospho how it works total FAK 1 plate assay protocol

检测验证

人癌细胞系中磷酸化 FAK（Tyr397）的积累

将人 MCF7 或 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，在有无过钒酸盐的条件下处理细胞 10 分钟。移除培养基后，加入 50µL 补充的 3 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物分装转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用磷酸酶抑制剂过钒酸盐处理后，FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平显著升高，而 FAK 蛋白的总含量未受过钒酸盐处理的影响。

Assay validation FAK total 1
Assay validation FAK total 2

利用 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测监测 FAK 抑制剂的药理学特性

将小鼠 NIH/3T3 成纤维细胞或人 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用不同浓度的 FAK 抑制剂处理细胞 30 分钟。移除培养基后，加入 50µL 补充的 3 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物分装转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 PF-562271 处理后，人 HeLa 细胞和小鼠 NIH/3T3 细胞系中 FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平均呈剂量依赖性降低，而 FAK 蛋白的总含量未受过钒酸盐处理的影响。

Assay validation FAK total 3
Assay validation FAK total 4

利用 HTRF FAK 检测作为监测生长因子受体激活的指标

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 24 孔胶原 I 包被板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，将细胞置于无血清条件下孵育。第三天，在无血清条件下用不同浓度的血管内皮生长因子（VEGF）处理细胞 5 分钟。移除培养基后，加入 250µL 补充的 3 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物分装转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

经 VEGF 刺激的 HUVEC 细胞中，FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平呈剂量依赖性升高。VEGF 通过调控 FAK 磷酸化在血管生成和细胞生长中发挥作用。

Assay validation FAK total 5

HTRF 磷酸化 FAK 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将小鼠 NIH/3T3 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至细胞汇合度达到 90%。加入 3mL 补充的 3 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

在补充的裂解缓冲液中对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 FAK 检测试剂。取等量裂解物通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。

使用 HTRF 总 FAK 试剂盒时，仅需 2,500 个细胞 / 孔即可检测到显著信号，而蛋白质印迹法需 5,000 个细胞才能检测到最小的 ECL 信号。因此，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。

Assay validation FAK total 6

简化通路

FAK 简化通路

这种多结构域蛋白在被细胞表面受体激活后会发生构象变化，这些受体主要包括整合素、细胞因子受体（IL1βR、TNFαR）、生长因子受体（EGFR、VEGFR、PDGFR）和 G 蛋白偶联受体（LPA、蛙皮素受体）。胞质中的非活性 FAK 单体被激活的受体招募至质膜，进而发生瞬时二聚化，并通过酪氨酸 397 位点的自磷酸化激活。该位点是 Src 家族激酶的停靠位点，可介导其他位点的磷酸化。完全激活的 FAK 会展现出与底物的结合位点，包括 Grb2、PI3K 和钙黏蛋白。FAK 作为 ECM / 整合素信号通路的核心调节因子，参与黏着斑的组装 / 解聚调控，在细胞黏附、迁移、存活和机械感知中发挥作用。在钙黏蛋白信号通路中，FAK 通过调控内皮 / 上皮细胞间的黏着连接，在细胞连接、血管通透性和血管生成中发挥作用。FAK 可激活多种底物并调控多条信号通路，如 Rho GTPases / 肌动蛋白（细胞骨架重组 / 细胞迁移）、钙黏蛋白 /β- 连环蛋白（细胞连接稳定性 / 血管通透性）、PI3K/AKT（细胞存活）、MAPKs ERK 和 JNK（细胞增殖）以及 p53/MDM2（抗凋亡）。

FAK simplified pathway

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64NAKPEG

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