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HTRF B-CATENIN TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 β- 连环蛋白（β-Catenin）细胞检测可稳定监测总 β- 连环蛋白的水平，并可与磷酸化 β- 连环蛋白试剂盒配合作为归一化检测。总 β- 连环蛋白是许多重要基因的关键共转录激活因子，这些基因参与胚胎发育、成人稳态维持和细胞增殖过程。

工作原理

总 β- 连环蛋白检测原理

总 β- 连环蛋白检测用于定量细胞裂解物中 β- 连环蛋白的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 β- 连环蛋白检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 β- 连环蛋白时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达。

总 β- 连环蛋白双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加总 β- 连环蛋白 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 β- 连环蛋白单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 β- 连环蛋白可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

利用磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人类 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度，并用 5µM 的 MG132 处理 3 小时。弃去细胞培养基，加入 3mL 补充的裂解缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白（T41/S33/S37）检测与蛋白质印迹法灵敏度相当，而 HTRF 总 β- 连环蛋白检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 9 倍。

利用磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测分析 GSK3 抑制剂 BIO 对 HEK293 细胞的剂量反应

将 200,000 个人类 HEK293 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用 MG-132 和不同浓度的 BIO 处理细胞 3 小时。裂解细胞时，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4µL HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

利用 HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测测量 MG-132 对蛋白酶体活性的抑制作用

将 200,000 个人类 HEK293 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用不同浓度的 MG-132 在不同孵育时间下处理细胞。裂解细胞时，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4µL HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化通路

β- 连环蛋白在经典 Wnt 通路中的作用

在缺乏细胞外 WNT 配体时，胞质中的 β- 连环蛋白在 Thr41/Ser37/Ser33 位点发生磷酸化，进而被泛素化、降解并失活。细胞外 WNT 配体与 Frizzled 受体和 / 或低密度脂蛋白受体相关蛋白 LRP5、LRP6 结合后，通过激活散乱蛋白（DVL）将信号传递到细胞内。这会导致降解复合体失活，使胞质中未磷酸化的 β- 连环蛋白积累，随后转运至细胞核内。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样本体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NCAPEY

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