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HTRF SMAD3 TOTAL KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述

总 SMAD3 细胞检测试剂盒旨在监测 SMAD3 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与我们的磷酸化 SMAD3 试剂盒兼容，可从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更有效地反映 TGF-ß 信号通路的活性。

工作原理

总 SMAD3 检测原理

总 SMAD3 检测可对细胞裂解物中 SMAD3 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMAD3 时，添加这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的格式，为评估蛋白表达提供了便捷手段。

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总 SMAD3 双板检测方案

双板方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，待裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再添加总 SMAD3 HTRF 检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。

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总 SMAD3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMAD3 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）设计方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

肝细胞和肝星状细胞中 TGF-ß/SMAD 信号通路的过度激活促进肝纤维化

将人 LX-2 * 细胞和 HepG2 细胞分别以 50,000 个 / 孔和 200,000 个 / 孔的密度接种，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。随后用不同浓度的 TGF-ß1 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 30 分钟。移除培养基后，加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物分装转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 SMAD3 或总 SMAD3 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。在两种细胞系中，TGF-ß1 处理均可诱导 SMAD3 的 Ser423/425 位点磷酸化，而蛋白的表达水平未受显著影响。

*LX-2 细胞系由 EMD Millipore 提供（货号 #SCC064）

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在小鼠 NIH/3T3 和 C2C12 细胞系中的验证

将小鼠 NIH/3T3 和 C2C12 细胞均以 100,000 个 / 孔的密度接种，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 小时。次日，用不同浓度的 TGF-ß1 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 30 分钟。移除培养基后，加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物分装转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 SMAD3 或总 SMAD3 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。在两种细胞系中，TGF-ß1 均可通过 Ser423/425 位点的磷酸化促进 SMAD3 的激活，而蛋白的表达水平保持相对稳定。

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利用总 SMAD3 检测对比 HTRF 检测与蛋白质印迹法

将细胞培养至 80% 汇合度，用 TGF-ß1 处理 30 分钟。裂解后，通过离心收集可溶性上清液。对裂解物进行系列稀释并转移至低体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 SMAD3 检测试剂。取等量裂解物通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。结果显示，HTRF 磷酸化 SMAD3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号通过 TßRI 和 TßRII 复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的 SMAD3。TGF-ß 配体与 TßRII 结合后，会招募 TßRI 进入配体 - 受体复合物。TßRII 发生自磷酸化，随后转磷酸化 TßRI。激活的 TßRI 进而磷酸化 SMAD3 的 Ser423 和 Ser425 位点，使其能够与 SMAD4 形成寡聚体。该复合物随后转运至细胞核，与共激活因子和共抑制因子共同作为转录因子，调控多个参与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化以及细胞外基质重塑和免疫 / 炎症反应的基因表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制。

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规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 1 号裂解缓冲液
- 3 号裂解缓冲液
- 4 号裂解缓冲液
- 5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：
- 心血管疾病
- 代谢 / 糖尿病
- 非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
- 肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64ND3PEG

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