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概述

总 EIF2α 细胞检测可监测总 EIF2α 的水平，并可与磷酸化 EIF2α 试剂盒配合作为归一化检测。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，肝细胞内的脂质蓄积（脂肪变性）会诱发氧化应激和内质网应激，导致磷酸化 EIF2α（Ser52）水平升高。磷酸化的 EIF2α 会减少整体蛋白质合成，并激活激活转录因子 4（ATF4），而 ATF4 可调节参与代谢、营养摄取、细胞氧化还原状态和细胞凋亡调控的特定基因的表达。

工作原理

总 EIF2α 检测原理

总 EIF2α 检测用于定量细胞裂解物中 EIF2α 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 EIF2α 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 EIF2α 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达。

总 EIF2α 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加总 EIF2α HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 EIF2α 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 EIF2α 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

在人类 HeLa 细胞上使用总 EIF2α 检测进行 HTRF 与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 MEMα 培养基中，于 T175 cm² 培养瓶中培养 2 天。在 37°C 条件下，用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A 处理细胞 10 分钟，然后用 3 mL 的 1X 补充裂解缓冲液 #4 裂解细胞。用补充裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 或蛋白质印迹法进行平行分析。使用 HTRF 总 EIF2α 试剂盒时，仅需 0.2 µg 的总蛋白即可检测到最小信号，这表明 HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

黄常山碱对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药理作用

用不同浓度的黄常山碱处理 HepG2 和 NIH-3T3 细胞。裂解后，将裂解物转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4 µL 的 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。黄常山碱处理会使 EIF2α 在 Ser52 位点的磷酸化水平显著升高，而其表达水平保持稳定。

毒胡萝卜素对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药理作用

在 HepG2 细胞上用毒胡萝卜素（一种通过诱发内质网应激来抑制肌浆网 / 内质网钙 ATP 酶的抑制剂）进行剂量反应实验。采用双板方案，用不同浓度的毒胡萝卜素处理细胞后进行裂解。将裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，最后添加 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。结果显示，EIF2α 的表达水平保持稳定，表明该化合物对细胞没有细胞毒性作用。

GSK2606414 对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药理作用

培养 HepG2 和 C2C12 细胞，用不同浓度的 GSK2606414（一种选择性 PERK 抑制剂）处理后，再用 500 nM 的毒胡萝卜素激活细胞。移除培养基后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4 µL 的 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

棕榈酸对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药理作用

采用双板检测方案，在 HepG2 细胞上用棕榈酸与牛血清白蛋白（BSA）的结合溶液进行剂量反应实验。然后在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的棕榈酸 / BSA 处理细胞 6 小时。加入裂解缓冲液后，将 16 µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，最后添加磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。记录 HTRF 信号，通过双向方差分析（2-way ANOVA）测试，结果表明棕榈酸会使 EIF2α 在 Ser52 位点的磷酸化水平显著升高。

简化通路

EIF2α 的功能与调节

真核起始因子 2（EIF2）在蛋白质翻译起始过程中是必需的，它能将起始甲硫氨酰 tRNA 转移到核糖体的 40S 核糖体亚基上。在多种细胞应激条件下，EIF2α 亚基的磷酸化是一种下调整体蛋白质合成的机制，这使细胞能够保存资源，同时启动新的基因表达程序以防止应激损伤。细胞应激有多种类型，如内质网应激、氨基酸缺乏或氧化应激。有四种激酶可响应不同类型的应激而磷酸化 EIF2α：HRI（红细胞中血红素缺乏时）、GCN2（氨基酸缺乏和营养匮乏时）、PKR（病毒感染时）和 PERK（内质网应激时）。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样本体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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HTRF EIF2 ALPHA TOTAL KIT - 50K PTS

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