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HTRF NFKB P-S536 KIT - 500 PTS 磷酸化NFkB（S536)蛋白检测试剂盒 - 500测试

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概述

磷酸化 NFkB（Ser536）细胞检测试剂盒是测量 Ser536 位点磷酸化 NFkB（核因子 κB）的理想工具，可将其作为 NFkB 通路的读数指标。NFkB 在多种癌症中频繁出现，并且是炎症反应中的关键参与者。

工作原理

磷酸化 NFkB（Ser536）检测原理

磷酸化 NFkB（Ser536）检测可对 Ser536 位点磷酸化的 NFkB 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 NFkB（Ser536）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的格式，为评估蛋白质磷酸化状态提供了便捷手段。

（图示：phospho-nfkb-ser536-assay-principle）

磷酸化 NFkB（Ser536）双板检测方案

双板方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 NFkB（Ser536）HTRF 检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。

（图示：phospho-nfkb-ser536-2-plate-assay-protocol）

磷酸化 NFkB（Ser536）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 NFkB（Ser536）可在单个微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解全过程，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）设计方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

（图示：phospho-nfkb-ser536-1-plate-assay-protocol）

检测验证

在多种人 / 鼠细胞中检测磷酸化 NFkB

将人源和鼠源细胞在含血清的培养基中培养，以每孔 40,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。通过 10 nM 肿瘤坏死因子 α（TNF alpha）或 2 nM 白细胞介素 1β（IL1 beta）刺激 10 分钟诱导蛋白质磷酸化。刺激后移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 µL 裂解液转移至 384 孔白色微量检测板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 NFkB（Ser536）检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

（图示：assay-validation-nfkb-phospho-s536-1）

磷酸化 NFkB 检测的 HTRF 法与 WB 法对比

人 HeLa 细胞培养 48 小时后用 TNFα 刺激，裂解后离心收集可溶性组分。将细胞裂解液进行系列稀释，分别通过蛋白质印迹法（Western Blot）和 HTRF 法平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化 NFkB 细胞检测的灵敏度高于蛋白质印迹法：使用 HTRF 磷酸化 NFkB 检测时，仅需 1,000 个细胞即可检测到最低信号，而蛋白质印迹法则需要 2,000 个细胞才能产生信号。

（图示：assay-validation-nfkb-phospho-s536-2）

使用磷酸化 NFkB 检测分析 TNFα 对 HeLa 细胞的剂量反应

接种 HeLa 细胞并培养 24 小时后，暴露于不同浓度的 TNFα 中。细胞裂解后，取 16 µL 裂解液转移至 384 孔白色微量检测板，加入 4 µL 磷酸化 NFkB（Ser536）检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，随着 TNFα 浓度增加，NFkB 的磷酸化水平相应升高。

（图示：assay-validation-nfkb-phospho-s536-3）

BAY 11-7085 对磷酸化 NFkB 和总 NFkB 的药理学影响

将 40,000 个 U937 细胞系细胞用不同浓度的 BAY 11-7085 处理 3 小时，同时用 10 nM TNFα 共刺激 10 分钟。细胞裂解后转移至 384 孔白色微量检测板，分别检测 HTRF 磷酸化 NFkB 和总 NFkB 水平。

（图示：assay-validation-nfkb-phospho-s536-4）

简化通路

NFkB 通路的调控机制

NFkB 属于一个超家族，包含 5 个成员，由同源或异源二聚体的两个亚基组成，参与免疫反应的调控。NFkB 通路主要分为两种：经典通路涉及 p65 和 p50，由细胞因子或 TLR（ toll 样受体）激活触发；替代通路则主要在淋巴细胞生成过程中被激活。未激活的 NFkB 二聚体被隔离在细胞质中，受到刺激后，IB 蛋白发生磷酸化、泛素化并降解，从而激活 NFkB 复合物，使其转运至细胞核内。激活的 NFkB 参与介导基因表达、炎症反应、细胞存活和细胞增殖。研究发现，NFkB 通路的失调与多种自身免疫性疾病以及部分癌症相关。

（图示：phospho-pathway-nfkb-64nfbpeg）

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：500 次检测

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