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HTRF NFKB P-S536 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 NFkB（Ser536）细胞检测试剂盒最适合用于检测 Ser536 位点磷酸化的 NFkB（核因子 κB），以此作为 NFkB 通路的读数指标。NFkB 在多种癌症中频繁出现，并且是炎症反应中的关键参与者。

工作原理

磷酸化 NFkB（Ser536）检测原理

磷酸化 NFkB（Ser536）检测用于测量在 Ser536 位点发生磷酸化的 NFkB。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 NFkB（Ser536）检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 NFkB（Ser536）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加磷酸化 NFkB（Ser536）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 NFkB（Ser536）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 NFkB（Ser536）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

在多种人类 / 小鼠细胞中检测磷酸化 NFkB

将处于无血清培养基中的人类和小鼠细胞以 40,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 10 nM 的肿瘤坏死因子 α（TNFα）或 2 nM 的白细胞介素 1β（IL1β）刺激 10 分钟，以诱导磷酸化状态。刺激后，移除培养基，用 50 µL 的裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4 µL 的 HTRF 磷酸化 NFkB（Ser536）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

利用磷酸化 NFkB 检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

培养人类 HeLa 细胞 48 小时，然后用肿瘤坏死因子 α（TNFα）刺激。裂解后，离心收集可溶性组分。对细胞裂解物进行系列稀释，分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化 NFkB 细胞检测比蛋白质印迹法更灵敏，因为使用 HTRF 磷酸化 NFkB 检测时，仅需 1,000 个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 2,000 个细胞才能产生信号。

利用磷酸化 NFkB 检测分析肿瘤坏死因子 α（TNFα）对 HeLa 细胞的剂量反应

接种 HeLa 细胞并培养 24 小时，然后暴露于不同浓度的肿瘤坏死因子 α（TNFα）中。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色微量检测板中，然后添加 4 µL 的磷酸化 NFkB（Ser536）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。随着肿瘤坏死因子 α（TNFα）浓度的增加，NFkB 的磷酸化水平相应升高。

BAY 11-7085 对磷酸化 NFkB 和总 NFkB 的药理作用

将 40,000 个 U937 细胞系细胞用不同浓度的 BAY 11-7085 处理 3 小时，同时用 10 nM 的肿瘤坏死因子 α（TNFα）共刺激 10 分钟。裂解细胞并转移到 384 孔白色微量检测板中，以检测 HTRF 磷酸化 NFkB。

简化通路

NFkB 通路的调节

NFkB 属于一个包含 5 个成员的超家族，由两个亚基组成（同源二聚体或异源二聚体），参与免疫反应的调节。主要存在两种 NFkB 通路：经典通路涉及 p65 和 p50，可被细胞因子或 Toll 样受体（TLR）激活；替代通路主要在淋巴细胞生成过程中被激活。非活性的 NFkB 二聚体被隔离在细胞质中。受到刺激后，IB 蛋白发生磷酸化、泛素化并降解，从而激活 NFkB 复合物，使其转运至细胞核内。激活的 NFkB 有助于介导基因表达、炎症反应、细胞存活和细胞增殖。已发现 NFkB 通路的失调与多种自身免疫性疾病以及某些类型的癌症相关。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NFBPEY

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