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HTRF FOXO1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 FoxO1 细胞检测可监测总 FoxO1 的含量，且可用作磷酸化 FoxO1 试剂盒的归一化检测。FoxO1 是叉头转录因子 FOXO 亚家族的成员，在胰岛素敏感组织中高表达，它能调节糖 / 脂代谢和应激 resistance。此外，它还通过抑制细胞增殖发挥肿瘤抑制因子的作用。FoxO1 的失调在糖尿病和非酒精性脂肪肝（NAFLD）等代谢紊乱疾病的发展中起着关键作用，其功能异常还与多种癌症相关。

工作原理

总 FoxO1 检测原理

总 FoxO1 检测用于定量细胞裂解物中 FoxO1 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 FoxO1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FoxO1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 FoxO1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再添加总 FGFR2 HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 FoxO1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 FGFR2 可在单个培养板中完成，该培养板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

胰岛素处理后 FoxO1 的失活

将人 HepG2 细胞和小鼠 C2C12 细胞接种并在高糖培养基中培养，然后用不同浓度的胰岛素处理 1 小时。裂解细胞后，将细胞裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，最后添加 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。在这两种细胞系中，胰岛素处理均可诱导 FoxO1 在 Ser256 位点磷酸化（失活），而其表达水平保持稳定。

细胞因子和氧化应激对 HepG2 细胞中 FoxO1 的激活作用

将人 HepG2 细胞接种并在高糖培养基中培养，然后用肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）/ 白细胞介素 - 1β（IL-1β）/ 白细胞介素 - 6（IL-6）混合物或过氧化氢（H₂O₂）处理。裂解细胞后，将可溶性细胞裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，最后添加 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。结果表明，促炎细胞因子和活性氧（ROS）通过诱导 HepG2 细胞系中 FoxO1 的去磷酸化（激活）来驱动代谢失调，而其表达水平保持稳定。

使用 PI3K 抑制剂渥曼青霉素在胰腺 β 细胞中激活 FoxO1

将小鼠胰腺 β 细胞系 Min-6 接种并在高糖培养基中培养 3 天，然后用不同浓度的渥曼青霉素处理 1 小时。裂解细胞后，将细胞裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，最后添加 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。结果显示，渥曼青霉素可抑制 PI3K/AKT 通路，导致 Min-6 细胞系中 FoxO1 去磷酸化（激活）。FoxO1 的表达水平保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。

在宫颈癌 HeLa 细胞系中使用 IGF-1 使 FoxO1 失活

将人 HeLa 细胞接种并在完全培养基中培养 24 小时，然后在无血清培养基中孵育过夜，再用不同浓度的胰岛素样生长因子 - 1（IGF-1）处理。裂解细胞后，将细胞裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，然后添加磷酸化或总 FoxO1 抗体。结果显示，生长因子 IGF-1 通过诱导 FoxO1 在 Ser256 位点磷酸化使其失活，从而促进肿瘤细胞增殖，且其表达水平保持稳定。

人 HEK293 细胞中 HTRF 磷酸化及总 FoxO1 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 HEK293 细胞接种并在完全培养基中培养至汇合度达到 90%。裂解细胞后，通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，然后转移到小体积白色微孔板中，再添加 HTRF 磷酸化或总检测抗体。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 的平行比较。结果显示，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。使用 HTRF 总 FoxO1 试剂盒时，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

FoxO1 简化通路

胰岛素 / IGF-1 信号通路会激活 AKT 激酶，进而使 FoxO1 在 Ser256 位点磷酸化，导致其在细胞质中滞留并抑制其转录活性。在这种情况下，肝葡萄糖生成受到抑制，脂肪生成增加，细胞增殖。相反，去磷酸化形式的 FoxO1 可转移到细胞核中，诱导参与葡萄糖生成、脂肪分解、抑制脂肪生成、应激抵抗、细胞凋亡、自噬和炎症的基因转录。在促炎细胞因子、氧化应激、禁食和运动的作用下，应激蛋白 JNK 和 p38 会激活 FoxO1。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/ 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NFOPEY

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