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HTRF NFKB TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 NFkB 试剂盒可作为我们磷酸化 NFkB 试剂盒的归一化检测工具。NFkB（核因子 κB）在癌症研究中备受关注，同时也是炎症反应中的关键参与者。HTRF 磷酸化 NFkB 检测和总 NFkB 检测的缓冲液具有兼容性，能够从一份裂解物样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白的含量。

工作原理

总 NFkB 检测原理

总 NFkB 检测可对细胞裂解物中 NFkB 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 NFkB 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 NFkB 时，添加这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的格式，为评估蛋白质表达提供了便捷手段。

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总 NFkB 双板检测方案

双板方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再添加总 NFkB HTRF 检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。

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总 NFkB 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 NFkB 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）设计方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

在多种人 / 鼠细胞中检测总 NFkB

将人源和鼠源细胞在去血清的细胞培养基中以每孔 40,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。通过 10 nM 肿瘤坏死因子 α（TNFα）或 2 nM 白细胞介素 1β（IL1β）刺激 10 分钟诱导蛋白质磷酸化。刺激后移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色微量检测板，加入 4 µL HTRF 总 NFkB 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

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总 NFkB 检测的 HTRF 法与 WB 法对比

人 HeLa 细胞培养 48 小时后用 TNFα 刺激，裂解后离心收集可溶性组分。将细胞裂解物进行系列稀释，分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 法平行分析。结果显示，HTRF 总 NFkB 细胞检测的灵敏度高于蛋白质印迹法：使用 HTRF 总 NFkB 检测时，仅需 1,000 个细胞即可检测到最低信号，而蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能产生信号。

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使用磷酸化和总 NFkB 试剂盒分析 TNFα 对 HeLa 细胞的剂量反应

接种 HeLa 细胞并培养 24 小时后，暴露于不同浓度的 TNFα 中。细胞裂解后，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色微量检测板，加入 4 µL 磷酸化 NFkB（Ser536）或总 NFkB 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，随着 TNFα 浓度增加，NFkB 的磷酸化水平相应升高，而总蛋白（包括未磷酸化和磷酸化形式）的总量保持稳定。

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BAY 11-7085 对磷酸化 NFkB 和总 NFkB 的药理学影响

实验表明，长时间暴露于 BAY 11-7085 会导致 NFkB 表达水平下调，表现为 HTRF 总 NFkB 信号降低。随着 BAY 浓度增加，NFkB 的磷酸化水平也随之下降。因此，通过磷酸化和总 NFkB 水平计算的归一化信号保持稳定。将 40,000 个 U937 细胞系细胞用不同浓度的 BAY 11-7085 处理 3 小时，同时用 10 nM TNFα 共刺激 10 分钟。细胞裂解后转移至 384 孔白色微量检测板，分别检测 HTRF 磷酸化 NFkB 和总 NFkB 水平。

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简化通路

NFkB 通路的调控机制

NFkB 属于一个超家族，包含 5 个成员，由同源或异源二聚体的两个亚基组成，参与免疫反应的调控。NFkB 通路主要分为两种：经典通路涉及 p65 和 p50，由细胞因子或 Toll 样受体（TLR）激活触发；替代通路则主要在淋巴细胞生成过程中被激活。未激活的 NFkB 二聚体被隔离在细胞质中，受到刺激后，IκB 蛋白发生磷酸化、泛素化并降解，从而激活 NFkB 复合物，使其转运至细胞核内。激活的 NFkB 参与介导基因表达、炎症反应、细胞存活和细胞增殖。研究发现，NFkB 通路的失调与多种自身免疫性疾病以及部分癌症相关。

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规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：
- 3 号裂解缓冲液
- 4 号裂解缓冲液
- 5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：
- 人
- 小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：
- 非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
- 神经科学
- 肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64NFTPEH

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