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HTRF SHP2 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 SHP2 细胞检测可监测 SHP2 的表达水平，并可与我们的磷酸化 SHP2 Y542 检测试剂盒配合作为归一化检测。由于这些磷酸化和总 SHP2 检测具有兼容性，这两种试剂盒可在相同的裂解物上平行使用。

许多癌细胞会过度表达检查点抑制剂配体，如 PD-L1。PD-L1 与其对应的检查点抑制剂受体 PD1 结合，而 PD1 存在于 T 淋巴细胞表面。反过来，PD1-PDL1 复合物会招募并激活抑制性效应因子，如 SHP1 或 SHP2。这两种磷酸酶分别通过激酶 Lck 在 Tyr564 和 Tyr542 上发生磷酸化，进而触发参与 T 细胞活化通路的信号蛋白（如 ZAP-70 或 SLP-76）的去磷酸化。最终，被激活的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的激活被认为有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理
总 SHP2 检测原理
总 SHP2 检测可测量 SHP2 的表达水平，且不受其磷酸化状态的影响。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 SHP2 检测使用两种标记抗体，一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SHP2 时，添加这些结合物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 SHP2 双板检测方案
双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再添加总 SHP2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 SHP2 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 SHP2 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
在 Jurkat T 细胞中使用 Lck 抑制剂沙雷替尼进行药理学验证
将人 Jurkat 悬浮细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔半区板中，在 37°C、5% CO₂条件下与不同浓度的沙雷替尼共同孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与过钒酸盐（30μM）孵育 30 分钟，随后加入 10μL 4X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他地方所述，处理后获得了对 SHP2 Tyr542 磷酸化的剂量依赖性抑制。

在经 PDGF 刺激的 NIH-3T3 小鼠细胞上的药理学验证
将小鼠 NIH 3T3 贴壁细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。过夜血清剥夺后，用不同浓度的 PDGF 刺激细胞 20 分钟。收集细胞培养基，并用 50μL 补充裂解缓冲液裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

如图所示，PDGF 刺激在 NIH3T3 细胞中诱导了强烈的 SHP2 Tyr542 磷酸化，而在相同实验条件下 SHP2 的表达保持稳定。

HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较
将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用过钒酸盐（30μM）处理细胞 30 分钟后进行裂解。在补充裂解缓冲液中对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的并列比较。使用 HTRF 总 SHP2 检测时，每孔 1,250 个细胞就足以检测到信号，而使用基于 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 20,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 总 SHP2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路
SHP2 的功能与调控
SHP1（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 6，PTPN6）是一种主要在造血细胞中表达的酪氨酸磷酸酶，由 Lck 激活并被细胞表面受体招募。SHP2（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 11）在造血细胞或非造血细胞中普遍表达。尽管 SHP2 负向调节 T 细胞活化，但它在响应 PDGF 或 FGF 等生长因子时正向参与 ERK 的活化。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 被免疫检查点抑制剂招募，从而参与 TCR 信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 与 PD1 的 ITIM 结构域相互作用，并被 Lck 激酶磷酸化和激活。被激活的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 TCR 信号通路中的关键效应因子（如 ZAP70 或 SLP76）去磷酸化，而这些效应因子是 T 细胞增殖和功能所必需的。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总蛋白
产品类别
试剂盒
样品体积
16μL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷酸蛋白
目标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
传染病
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

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货号：64NH2PEY

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