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HTRF MKK4 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

HTRF 总 MKK4 细胞检测可监测总 MKK4（促分裂原活化蛋白激酶激酶 4）水平，并可作为我们磷酸化 MKK4 检测试剂盒的归一化检测工具。本试剂盒与磷酸化 MKK4 试剂盒中的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于磷酸化蛋白和总蛋白群体的分析。

在细胞应激和促炎细胞因子的作用下，多种 MKK 激酶（如 TAK1、Tpl2 或 ASK1）可诱导 MKK4 的丝氨酸 257（Ser257）位点磷酸化。MKK4 磷酸化后，会优先触发 JNK（c-Jun 氨基末端激酶）的活化，而 JNK 可调控一系列与肿瘤发生、神经退行性疾病及纤维化相关的生物学过程。

工作原理

总 MKK4 检测原理

总 MKK4 检测可对细胞裂解物中 MKK4 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 MKK4 检测采用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对 MKK4 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 MKK4 时，加入这些抗体偶联物会使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 MKK4 蛋白的浓度呈直接正相关，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估该蛋白的表达水平。

（图：phospho-how-it-works-total-mkk4-assay-principle.svg）

总 MKK4 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解物转移至 384 孔低体积检测板后，再加入总 STING（干扰素基因刺激蛋白）HTRF 检测试剂（注：原文此处 “STING” 应为 “MKK4” 的笔误，依据上下文修正）。该方案可实现对细胞活力和汇合度的监测。

（标注：phospho-how-it-works-total-mkk4-2-plate-assay-protocol）

总 MKK4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 MKK4 时，可在同一块微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解操作，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（标注：phospho-how-it-works-total-mkk4-1-plate-assay-protocol）

检测验证

茴香霉素（Anisomycin）对维甲酸（RA）诱导分化的 SH-SY5Y 细胞的剂量效应

将人 SH-SY5Y 细胞（神经母细胞瘤细胞系）以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10μM 维甲酸（RA）的分化培养基中，在避光环境下孵育 1 周。需注意，由于维甲酸稳定性较差，含新鲜维甲酸的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用浓度递增的茴香霉素刺激 45 分钟。随后移除培养基，加入 50μL 1 倍浓度（1X）的补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他研究所述，茴香霉素可诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生剂量依赖性磷酸化，而在相同实验条件下，总 MKK4 水平略有下降。

（标注：assay-validation-mkk4-total-1）

过氧化氢（H₂O₂）对维甲酸（RA）诱导分化的 SH-SY5Y 细胞的刺激效应

将人 SH-SY5Y 细胞以每孔 400,000 个细胞的密度接种到 6 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10μM 维甲酸（RA）的分化培养基中，在避光环境下孵育 1 周。需注意，由于维甲酸稳定性较差，含新鲜维甲酸的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用 0.5mM 过氧化氢（H₂O₂）刺激 1 小时。随后移除培养基，加入 500μL 1 倍浓度（1X）的补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，过氧化氢可诱导 MKK4 的 Ser257 位点磷酸化，而在相同实验条件下，MKK4 的表达水平基本保持稳定。

（标注：assay-validation-mkk4-total-2）

茴香霉素对 HepG2 细胞的剂量效应及与蛋白质印迹法（Western Blot）的相关性

将人 HepG2 细胞（肝癌细胞系）以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用浓度递增的茴香霉素刺激 45 分钟。随后移除培养基，加入 50μL 1 倍浓度（1X）的补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。同时，取等量裂解物通过蛋白质印迹法进行平行实验分析。

如图所示，HTRF 检测与蛋白质印迹法均显示：MKK4 磷酸化水平升高，同时 MKK4 表达水平降低。

（标注：assay-validation-mkk4-total-3）
（标注：assay-validation-mkk4-total-4）

HTRF 总 MKK4 细胞检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。用 1M 山梨糖醇（Sorbitol）刺激细胞 30 分钟后进行裂解。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16μL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4μL HTRF 总 MKK4 检测试剂。取等量裂解物通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。

结果显示，使用 HTRF 总 MKK4 检测时，每孔仅需 1,250 个细胞即可检测到信号；而使用基于化学发光（ECL）检测的蛋白质印迹法时，需 10,000 个细胞才能检测到信号。这些结果表明，HTRF 总 MKK4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

（标注：assay-validation-mkk4-total-5）

简化通路

MKK4 检测相关简化通路

MKK4（促分裂原活化蛋白激酶激酶 4）是 MAP 激酶激酶家族的成员。在 G 蛋白偶联受体（GPCR）激活、生长因子、细胞应激或炎性细胞因子等刺激下，多种 MKKK（MAP 激酶激酶激酶，如 TAK1、ASK1）被激活，进而使 MKK4 的 Ser257 位点发生磷酸化，最终激活 MKK4。随后，活化的 MKK4 通过磷酸化 JNK 或 p38，进一步激活 c-Jun、p53 或 ATF2 等下游分子，通过调控基因转录过程，参与炎症反应、细胞存活 / 凋亡、增殖或分化等生物学过程。

（图：phospho-pathway-mkk4-total-64nk4peg）

规格参数

其他规格

应用领域（Application）：细胞信号传导
品牌（Brand）：HTRF
检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光）
兼容裂解缓冲液（Lysis Buffer Compatibility）：
- 1 号裂解缓冲液
- 2 号裂解缓冲液
- 3 号裂解缓冲液
- 4 号裂解缓冲液
- 5 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样品体积（Sample Volume）：16μL
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输
靶标类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶标物种（Target Species）：人（Human）
技术原理（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域（Therapeutic Area）：
- 非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
- 神经科学（Neuroscience）
- 肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格（Unit Size）：500 个检测点（500 assay points）

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