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HTRF MKK4 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

HTRF 总 MKK4 细胞检测试剂盒可监测总 MKK4 水平，且能与我们的磷酸化 MKK4 试剂盒配合使用，作为归一化检测工具。该试剂盒与磷酸化 MKK4 试剂盒的缓冲液兼容，因此可使用同一份裂解物对磷酸化蛋白和总蛋白群体进行分析。

在细胞应激和促炎细胞因子的刺激下，多种 MKK 激酶（如 TAK1、Tpl2 或 ASK1）会诱导 MKK4 的丝氨酸 257（Ser257）位点发生磷酸化。MKK4 磷酸化后，会优先触发 JNK 的激活，而 JNK 可调控一系列与肿瘤发生、神经退行性疾病和纤维化相关的生物学过程。

工作原理

总 MKK4 检测原理

总 MKK4 检测可定量细胞裂解物中 MKK4 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 MKK4 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 MKK4 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 MKK4 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入总 STING HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

总 MKK4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 MKK4 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

茴香霉素对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的剂量反应

将人 SH-SY5Y 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10μM RA 的分化培养基中，在暗处孵育 1 周。请注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用不同浓度的茴香霉素刺激 SH-SY5Y 细胞 45 分钟。然后移除培养基，加入 50μL 的 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他文献所述，茴香霉素可诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生剂量依赖性磷酸化，而在相同实验条件下，总 MKK4 水平略有下降。

H₂O₂对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的刺激作用

将人 SH-SY5Y 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10μM RA 的分化培养基中，在暗处孵育 1 周。请注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用 0.5 mM H₂O₂刺激 SH-SY5Y 细胞 1 小时。然后移除培养基，加入 500μL 的 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。H₂O₂可诱导 MKK4 的 Ser257 位点磷酸化，而在相同实验条件下，MKK4 的表达水平几乎保持稳定。

茴香霉素对 HepG2 细胞的剂量反应及与蛋白质印迹法的相关性

将人 HepG2 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用不同浓度的茴香霉素刺激细胞 45 分钟。然后移除培养基，加入 50μL 的 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。在平行实验中，取等量裂解物进行蛋白质印迹分析。

如图所示，HTRF 检测和蛋白质印迹法均显示 MKK4 磷酸化水平增加，同时 MKK4 表达水平下降。

HTRF 总 MKK4 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用 1 M 山梨糖醇刺激细胞 30 分钟，之后进行裂解。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 总 MKK4 检测试剂。取等量裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 MKK4 检测时，1,250 个细胞 / 孔即可检测到信号，而使用基于 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 总 MKK4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

MKK4 检测相关简化通路

MKK4（丝裂原活化蛋白激酶激酶 4）是 MAP 激酶激酶家族的成员，在不同 MKKK（如 TAK1 或 ASK1）激活后，可通过 Ser257 位点的磷酸化而被激活，以响应 GPCR 激活、生长因子、细胞应激或炎性细胞因子等刺激。反过来，激活的 MKK4 会磷酸化 JNK 或 p38，进而激活 c-jun、p53 或 ATF2，并通过调控基因转录来诱导炎症、细胞存活 / 凋亡、增殖或分化。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NK4PEY

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