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HTRF人源总核转录因子红系2相关因子2检测试剂盒-10000测试

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概述

HTRF 人 / 小鼠 NRF2 检测试剂盒可监测多种细胞内源性 NRF2 的表达水平。

活性氧（ROS）过量产生会导致细胞内氧化应激。NRF2 受 KEAP1 调控：在细胞应激状态下，NRF2 发生磷酸化，从而从 KEAP1 蛋白上解离；随后 NRF2 转位至细胞核内。作为转录因子，NRF2 可激活多种细胞保护基因的转录，其中包括与癌症及神经退行性疾病（NDD）防护相关的 p62SQSTM1 基因。

工作原理

HTRF 人 / 小鼠总 NRF2 检测原理

HTRF 人 / 小鼠总 NRF2 检测可对细胞裂解液中 NRF2 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板开展，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人总 NRF2 检测采用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对 NRF2 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 NRF2 时，加入这些抗体偶联物会使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生 FRET 信号。该信号强度与样品中 NRF2 蛋白的浓度呈直接正相关，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估该蛋白的表达水平。

（标注：assay-principle-total-nrf2-64nrf2tpeg）

人 / 小鼠总 NRF2 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔低体积检测板后，再加入人 / 小鼠总 NRF2 HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力和汇合度的监测。

（标注：assay-protocol-how-it-works-total-nrf2-64nrf2tpeg）

人 / 小鼠总 NRF2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测人 NRF2 时，可在同一块微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解操作，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（标注：assay-protocol-how-it-works-total-nrf2-64nrf2tpeg）

检测验证

化合物诱导 NRF2 释放的检测

将 Hep-G2 细胞以每孔 200,000 个的密度接种到 96 孔细胞培养板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。随后用浓度递增的叔丁基对苯二酚（tBHQ）、Ki696 和毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 16 小时；之后加入 50 微升 1 号补充裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 总 NRF2 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后，记录 HTRF 信号。

结果符合预期：这些化合物可诱导 NRF2 从 Keap1 上解离，使 NRF2 信号水平呈剂量依赖性升高，且不同化合物的半数有效浓度（EC50）存在差异 ——Ki696 为 38 纳摩尔，毒胡萝卜素为 0.3 微摩尔，叔丁基对苯二酚为 29 微摩尔。

（标注：assay-validation-total-nrf2-64nrf2tpeg-activator）

不同人源和鼠源细胞系中 NRF2 水平的评估

将贴壁生长的人源和鼠源细胞（Hep-G2、HEK-293、HAP1、NIH 3T3）以每孔 100,000 个或 200,000 个的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用叔丁基对苯二酚在 37°C 条件下处理细胞 16 小时，随后加入 1 号补充裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞。接下来，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 NRF2 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，HTRF 总 NRF2 检测可在表达不同水平 NRF2 蛋白的多种细胞模型中有效检测到 NRF2 蛋白。

（标注：assay-validation-total-nrf2-64nrf2tpeg）

HTRF 总 NRF2 检测的特异性验证

将 HAP1 细胞和 HAP1 NRF2 敲除（KO）细胞（购自 Biolegend）在 T175 培养瓶中加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。加入 3 毫升 1 号补充裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟；之后取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 NRF2 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，HAP1 NRF2 敲除细胞未检测到信号，而野生型（wt）HAP1 细胞可检测到信号，由此证明该检测对 NRF2 蛋白具有特异性。

（标注：assay-validation-total-nrf2-64nrf2tpeg）

HTRF 人总 NRF2 检测与蛋白质印迹法的比较

将 Hep-G2 细胞在 T175 培养瓶中加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 100 微摩尔的叔丁基对苯二酚化合物在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时，随后加入 3 毫升 1 号补充裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用 1 号补充裂解缓冲液（1X）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF（人 / 小鼠）总 NRF2 检测试剂。

取等量裂解液，通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

结果显示，在该实验条件下，HTRF 总 NRF2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

（标注：assay-validation-total-nrf2-64nrf2tpeg）

简化通路

NRF2 信号通路

活性氧（ROS）过量产生会导致细胞内氧化应激，进而引发多种病理生理状态，尤其是癌症和神经退行性疾病（NDD）。Keap1-Nrf2（Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1 - 核因子 E2 相关因子 2）调控通路在保护细胞抵御氧化应激和异源物质应激中发挥核心作用。

NRF2 受 KEAP1 调控，在细胞应激状态下发生磷酸化，从而从 KEAP1 蛋白上解离。游离的 NRF2 转位至细胞核内，作为转录因子激活多种细胞保护基因的转录，其中包括与癌症及神经退行性疾病防护相关的 p62SQSTM1 基因。这两种蛋白（NRF2 和 p62SQSTM1）是自噬通路的重要调控因子。

（标注：pathway-total-nrf2-64nrf2tpeg）

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：
- 1 号裂解缓冲液
- 2 号裂解缓冲液
- 3 号裂解缓冲液
- 4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：TR-FRET
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64NRF2TPEH

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