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HTRF IRS1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

HTRF 总胰岛素受体底物 1（IRS1）检测试剂盒设计用于与我们的磷酸化 IRS1 试剂盒搭配，作为标准化检测工具使用。总 IRS1 检测是监测胰岛素抵抗的理想方法。IRS1 是与胰岛素抵抗、肿瘤发生及转移进展相关的重要标志物，且与 2 型糖尿病、肥胖症和癌症存在关联。

工作原理

总 IRS1 检测原理

总 IRS1 检测可对细胞裂解液中 IRS1 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 IRS1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 IRS1 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 IRS1 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 IRS1 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测格式下，可用于评估蛋白的表达水平。

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总 IRS1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，最后加入总 IRS1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的存活率和融合度。

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总 IRS1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 IRS1 时，可在同一块微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解操作。该方案无需清洗步骤，是专为高通量筛选（HTS）设计的检测方法，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

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检测验证

总 IRS1 检测在 C2C12 小鼠肌管细胞中的验证

将 C2C12 细胞培养至融合度达到 100%，随后在含 2% 马血清的培养基中培养 7 天，以诱导细胞分化。在无血清培养基中进行饥饿处理后，用促炎细胞因子混合物和 / 或胰岛素处理细胞。移除细胞上清液后，加入 1.5 mL 补充后的 1 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡，裂解细胞 30 分钟。之后取 16 μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，使用磷酸化 IRS1 和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测。

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总 IRS1 检测在 3T3-L1 小鼠脂肪细胞中的验证

将 3T3-L1 细胞在含 10% 新生牛血清的培养基中培养，随后在含 10% 胎牛血清（FCS）、胰岛素、地塞米松、3 - 异丁基 - 1 - 甲基黄嘌呤（IBMX）和微摩尔级噻唑烷二酮的培养基中培养 7 天，以诱导细胞从成纤维细胞分化为脂肪细胞。在无血清培养基中进行过夜饥饿处理后，用 100 nM 胰岛素处理细胞 45 分钟，或用促炎细胞因子混合物处理细胞 30 分钟。移除细胞上清液后，裂解细胞并将裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，使用磷酸化 IRS1 和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测（样品由法国尼斯 C3M 研究所、INSERM U1065/UNS 联合实验室 JF Tantis 研究团队友情提供）。

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总 IRS1 检测在 MCF-7 人乳腺癌细胞中的验证

将 50,000 个人乳腺癌 MCF-7 细胞接种到含完全培养基的 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入浓度递增的胰岛素，在 37°C 条件下孵育 45 分钟。移除细胞培养基后，加入 50 μL 裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡，裂解细胞 30 分钟。之后取 16 μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 μL HTRF 检测试剂，对磷酸化 IRS1（丝氨酸 312 位点）和总 IRS1 进行检测。

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磷酸化 IRS1 检测在 MCF-7 人乳腺癌细胞中的验证

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简化通路

IRS1/PI3K/AKT 信号通路

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IRS1/PI3K/AKT 信号通路的调控

通路的抑制

酪氨酸磷酸化的 IRS1 对胰岛素信号通路起正向调控作用，而丝氨酸磷酸化通常作为负反馈信号，下调 IRS1 的功能。在脂肪组织和骨骼肌中，IRS1 丝氨酸磷酸化水平升高是胰岛素抵抗的标志性特征。胰岛素或胰岛素样生长因子 1（IGF-1）与胰岛素受体（IR）或 IGF-1 受体（IGF-1R）的细胞外 α 亚基结合，会触发受体跨膜 β 亚基的自身磷酸化，进而激活受体。IRS1/AKT 通路的激活对维持葡萄糖稳态至关重要。AKT 还可激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），而 mTOR 可介导细胞生长、存活及蛋白质合成。IRS1 表达下调是糖尿病的重要标志物，其过表达则与肿瘤转移和癌症相关。

通路的激活

胰岛素或 IGF-1 与 IR 或 IGF-1R（或两种受体的杂合体）的细胞外 α 亚基结合，会触发受体跨膜 β 亚基的自身磷酸化。随后，活化的酪氨酸激酶受体会招募 IRS1，并使 IRS1 的多个酪氨酸残基磷酸化，在细胞膜上形成磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）的结合位点。PI3K 通路随之被激活，下游的 AKT 发生磷酸化，进而磷酸化 AS160、糖原合成酶激酶 3（GSK3）和叉头框蛋白 O1（FoxO1），分别导致葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）转位 / 葡萄糖摄取、糖原合成及糖异生抑制。因此，IRS1/AKT 通路的激活对维持葡萄糖稳态至关重要。AKT 还可激活 mTOR，mTOR 则介导细胞生长、存活及蛋白质合成。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF（均相时间分辨荧光）
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 μL
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/ 纤维化
单位规格：10,000 次检测

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货号：64NRSPEH

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