当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF TBK1 TOTAL KIT - 50K PTS

HTRF TBK1 TOTAL KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64NTBPEY_US rvty_ls_sds_64NTBPEY_UK rvty_ls_sds_64NTBPEY_SPA rvty_ls_sds_64NTBPEY_ITA rvty_ls_sds_64NTBPEY_ELL rvty_ls_sds_64NTBPEY_DEU rvty_ls_sds_64NTBPEY_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

总 TBK1 细胞检测旨在监测 TBK1 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它与我们的磷酸化 TBK1 试剂盒兼容，能够从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 T 细胞的激活情况。在病原体感染后，TBK1 可被细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸激活，进而触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活。

检测原理
总 TBK1 检测原理
总 TBK1 检测用于定量细胞裂解物中 TBK1 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 TBK1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 TBK1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样本中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测形式下即可评估蛋白质的表达。

总 TBK1 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 TBK1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 TBK1 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 TBK1 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证
通过总 TBK1 分析监测库普弗细胞中的 LPS/TLR4 轴
将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）接种在 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用在无血清培养基中稀释的不同浓度 LPS 处理细胞 1 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 #4 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 µL 裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，再添加 4 µL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。LPS 诱导 TLR4 信号激活，导致 TBK1 的 Ser172 位点磷酸化水平增加 3 倍。该激酶的表达水平保持稳定，这表明 LPS 不会产生任何细胞毒性作用。

通过总 TBK1 分析监测 cGAS-STING 通路的激活
将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）接种在 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用在无血清培养基中稀释的不同浓度 23-cGAMP 处理细胞 1 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 #4 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 µL 裂解物两次转移到小体积白色微孔板中，再添加 4 µL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。用 23-cGAMP 处理细胞会导致 STING 激活，进而触发 TBK1 的 Ser172 位点磷酸化水平增加 3.6 倍。正如预期的那样，该激酶的表达水平保持恒定。

HTRF 磷酸化和总 TBK1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较
将人宫颈癌 HeLa 细胞系接种在 T175 培养瓶中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至达到 90% 的汇合度。然后用 200 nM 花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，并用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。在补充的裂解缓冲液中对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF® 磷酸化或总 TBK1 检测抗体。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。使用 HTRF® 磷酸化或总 TBK1 试剂盒，每孔仅需 1,250 个细胞即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法检测最小 ECL 信号则需要 2,500 个细胞。因此，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 2 倍。

简化通路
TLR3/4 和 cGAS-STING 简化通路
TBK1（TANK 结合激酶 1，也称为 NAK）是一种通过 Ser172 位点自磷酸化而激活的多聚激酶。该激酶是多种通路之间的关键信号节点，这些通路可导致炎症和自噬。在病原体感染后，TBK1 可被细菌 LPS 和病原体核酸激活，进而触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活。当 LPS 与细胞表面的 TLR4 结合后，该受体转移到内体并招募 TRAM 蛋白，TRAM 蛋白进而激活 TRIF 蛋白。同样，进入细胞的双链 RNA（dsRNA）与内体中的 TLR3 结合，直接激活 TRIF。对于双链 DNA（dsDNA），它进入细胞并与细胞质传感器 cGAS 结合，诱导产生 23-cGAMP，进而激活衔接蛋白 STING。在上述每种通路被激活后，TBK1 被招募到不同的信号复合物中，并通过 Ser172 位点的自磷酸化而激活。该激酶进而激活转录因子 IRF3，IRF3 转移到细胞核中并诱导 I 型干扰素基因的表达，从而引发炎症反应。TBK1 还参与自噬过程，它直接磷酸化自噬受体视神经萎缩蛋白（optineurin）和 p62，这些受体将蛋白质 cargo 靶向运输到自噬体。

规格

其他规格
应用领域
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样本体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸化蛋白
靶标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

没有数据

货号：64NTBPEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价