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HTRF STING TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

总 STING 细胞检测法可监测总 STING（干扰素基因刺激蛋白），并可作为我们磷酸化 STING 试剂盒的归一化检测方法。该试剂盒与磷酸化 STING 试剂盒中的缓冲液兼容，因此同一份裂解液可用于分析磷酸化蛋白群体和总蛋白群体。

在病原体感染以及双链 DNA（dsDNA）与细胞质传感器 cGAS（环磷酸鸟苷 - 腺苷酸合成酶）结合后，STING 蛋白会被 TBK1（TANK 结合激酶 1）磷酸化，使其能够与 IRF3（干扰素调节因子 3）结合，进而诱导 I 型干扰素的产生。随后，STING 通路会通过自噬相关的 STING 降解过程被关闭。

在肿瘤免疫领域，激活 STING 通路在临床前模型中已显示出良好的抗肿瘤效果，因此这一通路成为了治疗人类癌症的一种潜在治疗策略。

工作原理

总 STING 检测原理

总 STING 检测法可对细胞裂解液中 STING 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测法完全基于微孔板进行，无需使用凝胶、无需进行电泳或转膜操作。总 STING 检测法使用两种带标记的抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都对 STING 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 STING 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中 STING 蛋白的浓度直接相关，且该检测法采用 “无需洗涤” 的检测形式，为评估蛋白质表达水平提供了便利。

总 STING 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，之后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 STING HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案能够监测细胞的存活率和汇合度。

总 STING 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STING 时，可在同一块微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解操作。该方案无需洗涤步骤，是专为高通量筛选（HTS）设计的检测方案，能够实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

2’-3’- 环磷酸鸟苷 - 腺苷酸（2’3’cGAMP）诱导 THP1 细胞中 STING 磷酸化

将人 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）在完全培养基中以 25 微升的体系接种到 96 孔板中（每孔 40 万个细胞）。用不同浓度的 2’3’cGAMP（5 微升体系）刺激细胞 4 小时。随后，加入 10 微升 4 倍浓度的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟，使细胞裂解。将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 微升 HTRF 磷酸化 STING 或总 STING 检测抗体。同时，使用相应的 HTRFα- 微管蛋白内参试剂盒，从 4 微升细胞裂解液中分析内参蛋白 α- 微管蛋白。最后，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他文献所述，2’3’cGAMP 可显著激活 STING 通路，使 STING 磷酸化水平提高 6 倍。STING 磷酸化水平升高的同时，其表达水平会下调（这与自噬介导的降解过程一致），而在相同条件下，α- 微管蛋白的表达水平保持稳定。

HTRF 磷酸化 STING 和总 STING 检测法可准确定量激动剂诱导的 STING 调控

将 40 万个 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）在完全培养基中以 25 微升的体系接种到 96 孔板中。用不同浓度的 2’3’cGAMP（5 微升体系）刺激细胞 4 小时。随后，加入 10 微升 4 倍浓度的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟，使细胞裂解。分别采用 HTRF 检测法和蛋白质印迹法，对 16 微升裂解液进行平行分析。

通过 HTRF 法对信号进行定量，可对化合物的作用进行准确的统计分析 —— 如下图所示，400 微摩尔浓度的 cGAMP 可显著降低总 STING 和磷酸化 STING 的水平（所用统计方法：单因素方差分析，P 值 < 0.0001）。

总 STING 细胞检测法与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将人 THP1-R232 细胞系在完全培养基中接种到 T175 培养瓶中，在 37℃、5% 二氧化碳条件下孵育 2 天。随后，用 100 微摩尔浓度的 2’3’cGAMP 刺激细胞 4 小时，加入 3 毫升补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟，使细胞裂解。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 微升 HTRF 总 STING 检测抗体。取等量裂解液，采用 HTRF 检测法和蛋白质印迹法进行平行对比分析。

使用总 STING 试剂盒时，每孔仅需 4000 个细胞，HTRF 检测法和蛋白质印迹法就能检测到显著信号。因此，在本实验中，两种方法对总 STING 蛋白的检测灵敏度相近。

简化通路

STING（干扰素基因刺激蛋白）是一种定位于内质网的细胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥关键作用。当病原体感染发生或细胞凋亡过程中线粒体收缩时，游离的双链 DNA（dsDNA）会与 DNA 传感器 cGAS（环磷酸鸟苷 - 腺苷酸合成酶）结合并使其激活。激活后的 cGAS 会催化生成环二核苷酸 2’-3’cGAMP，该分子随后与 STING 蛋白结合。接着，磷酸化的 STING 会与 TBK1（TANK 结合激酶 1）相互作用，进而招募并激活干扰素调节因子 3（IRF3）二聚体。IRF3 二聚体进入细胞核后，会启动编码 I 型干扰素（IFN-α/β）的基因转录。此外，STING 通路还调控核因子 κB（NF-κB）依赖性炎症细胞因子的表达。作为一种负反馈机制，DNA 刺激激活的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62/SQSTM1 相关的自噬作用触发 STING 蛋白降解，从而关闭 I 型干扰素（IFNb）的产生。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：兼容裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰类型：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒（Kit）
样品体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶标物种：人（Human）
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：感染性疾病、肿瘤与炎症
单位规格：500 次检测用量

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货号：64NTGPEG

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