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HTRF (H/M) P300 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 p300 细胞检测试剂盒可便捷、准确地检测细胞内总 p300 蛋白的水平。该试剂盒与总 CREBBP 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解液可用于分析这两种家族成员蛋白（p300 与 CREBBP）。

p300（又称 EP300 或 KAT3B）及其同源蛋白 CREBBP（环磷腺苷应答元件结合蛋白结合蛋白，又称 CBP 或 KAT3A）是关键的转录共激活因子。这两种赖氨酸乙酰转移酶（KAT）共同构成了包含两个成员的 KAT3 家族。它们通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和转录共调节因子上特定赖氨酸残基进行乙酰化修饰，来调控基因转录。p300 和 CREBBP 作为信号网络的 “枢纽”，可与 400 多种蛋白质相互作用，调控参与细胞增殖、稳态等基础细胞过程的基因表达。

涉及 p300/CREBBP 的基因突变或染色体易位会导致基因调控异常，进而引发癌症、神经退行性疾病、炎症性疾病等多种人类疾病。近年来，针对 p300/CREBBP 的 PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）降解剂已被开发用于人类癌症治疗。

工作原理

总 p300 检测原理

总 p300 检测可对细胞裂解液中 p300 蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 p300 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 p300 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 p300 蛋白时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 p300 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估 p300 蛋白的表达水平。

assay-principle-total-p300-64p300tpeg-64p300tpeh-64p300tpey（图示：总 p300 检测原理）

总 p300 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 p300 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可监测细胞的存活率和融合度。

assay-protocol-how-it-works-total-p300-64p300tpeg-01（图示：总 p300 双板检测方案）

总 p300 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 p300 蛋白时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

assay-protocol-how-it-works-total-p300-64p300tpeg-02（图示：总 p300 单板检测方案）

检测验证

3 种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂作用机制的表征

实验采用贴壁细胞双板检测方案进行。将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（每孔 70,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养过夜。次日，先用 1 微摩尔（µM）环氧酶素（Epoxomicin）预处理细胞 1 小时，随后再用 3 个剂量的每种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂（包括 PROTAC CBP/p300 降解剂 - 1、沙利度胺 - NH-CBP/p300 配体 2、dCBP-1）处理细胞 5 小时，同时以弹头分子 GNE-781 作为阴性对照（三种 PROTAC 降解剂共用该对照）。用 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 微升总 p300 或总 CREBBP HTRF 检测试剂盒的检测抗体（总 CREBBP HTRF 试剂盒，货号 64CREBBPTPEG/Y）。两种检测均孵育过夜后，记录 HTRF 信号。同时，取 5 微升相同裂解液转移至 96 孔小体积白色 HTRF 板（货号 66PL96005/025/100）中，加入 25 微升 ATPlite 一步法检测试剂（ATPlite 一步法发光检测系统，货号 6016736/1/9），通过该方法评估细胞存活率；在黑暗环境中孵育 10 分钟后，检测发光信号。

处理 5 小时后，三种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂均以剂量依赖性方式导致 p300 和 CREBBP 的信号下降，而弹头分子 GNE-781 未引起任何变化，这与预期结果一致。从 ATPlite 检测结果图可见，这些化合物未产生细胞毒性。此外，在蛋白酶体抑制剂环氧酶素存在的情况下，HTRF 信号得以恢复。综上，实验结果明确表明，PROTAC 降解剂可通过泛素 - 蛋白酶体系统诱导 p300/CREBBP 降解。

assay-validation-pharmacological-mechanism-of-action-total-p300-01（图示：总 p300 检测验证 1）

assay-validation-pharmacological-mechanism-of-action-total-02（图示：总 p300 检测验证 2）

assay-validation-pharmacological-mechanism-of-action-total-03（图示：总 p300 检测验证 3）

3 种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂的剂量效应与时间进程研究

实验在 HeLa 细胞上进行，操作步骤与上一部分基本一致，不同之处在于：用浓度递增的每种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂（或弹头分子 GNE-781）分别处理细胞 4 小时或 20 小时。如前所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 p300 和总 CREBBP 蛋白水平，通过 ATPlite 一步法发光试剂盒检测细胞存活率。

三种 PROTAC 降解剂均以剂量依赖性方式诱导 p300 和 CREBBP 降解，而弹头分子 GNE-781 无此效应。这些化合物对两种蛋白的作用表现相近（如效价和动力学特征）。两种处理时间下，三种降解剂的效价排序一致：沙利度胺 - NH-CBP/p300 配体 2 的效价分别是 PROTAC CBP/p300 降解剂 - 1 的 4 倍、dCBP-1 的 10 倍（基于半数降解浓度 DC50 值）。处理 20 小时后，PROTAC CBP/p300 降解剂 - 1 和 dCBP-1 的效价显著提升（提升 2.5 至 5 倍），沙利度胺 - NH-CBP/p300 配体 2 的降解效率也从 65% 提升至 80%。值得注意的是，即使处理 20 小时，这些化合物也未引起明显的细胞毒性（ATPlite 一步法检测，数据未展示）。

assay-validation-pharmacological-dose-effect-total-p300-01（图示：总 p300 检测验证 4）

assay-validation-pharmacological-dose-effect-total-p300-02（图示：总 p300 检测验证 5）

assay-validation-pharmacological-dose-effect-total-p300-03（图示：总 p300 检测验证 6）

assay-validation-pharmacological-dose-effect-total-p300-04（图示：总 p300 检测验证 7）

总 p300 与总 CREBBP 检测特异性验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（总 p300 检测每孔 12,500 个细胞，总 CREBBP 检测每孔 50,000 个细胞，均使用完全培养基），在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养过夜。次日，用特异性靶向人 p300 或其同源蛋白人 CREBBP 的 ON-TARGETplus SMARTPool 小干扰 RNA（siRNA）转染细胞，同时以非靶向 siRNA 作为阴性对照。siRNA 孵育 24 小时后更换培养基，继续孵育 24 小时，随后用 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解后，如第一部分所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 p300 和总 CREBBP 蛋白水平，通过 ATPlite 一步法发光试剂盒检测细胞存活率。

siRNA 实验结果显示，总 p300 和总 CREBBP HTRF 试剂盒均能特异性检测目标蛋白，且不会识别家族中的另一种蛋白。具体而言，p300 siRNA 处理使总 p300 检测的信号下降 86%，而 CREBBP 基因沉默未导致该检测信号下降；反之，CREBBP siRNA 处理使总 CREBBP 检测的信号下降 70%，而 p300 基因敲低未导致该检测信号下降。在 p300 和 CREBBP siRNA 存在的情况下，ATPlite 发光信号保持稳定，表明 HTRF 信号下降与细胞毒性无关。

assay-validation-assay-specificity-selectivity-total-p300-01（图示：总 p300 检测验证 8）

assay-validation-assay-specificity-selectivity-total-p300-02（图示：总 p300 检测验证 9）

不同人源和鼠源细胞系中总 p300 水平的评估

实验采用贴壁细胞双板检测方案进行。将人源细胞系（HeLa、SH-SY5Y、MCF7、A549、A431）和鼠源细胞系（NIH-3T3、Neuro-2a）接种到 96 孔培养板中（每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。次日，用 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，加入 4 微升总 p300 HTRF 检测试剂盒的检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果表明，总 p300 HTRF 试剂盒适用于人源和鼠源细胞模型，且能有效检测不同 p300 蛋白表达水平细胞系中的 p300。

assay-validation-assay-versatility-total-p300（图示：总 p300 检测验证 10）

总 p300 HTRF 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至融合度约 90%。随后，用 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，并用该补充裂解缓冲液对裂解液进行系列稀释。检测总 p300 时，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，加入 4 微升总 p300 HTRF 检测试剂。取等量裂解液上样至凝胶，与 Western Blot 进行平行对比。

结果显示，使用总 p300 HTRF 检测时，每孔仅需 1,000 个细胞即可检测到显著信号；而使用 Western Blot 检测最低化学发光信号时，需 8,000 个细胞。因此，在本实验条件下，总 p300 HTRF 检测的灵敏度是 Western Blot 技术的 8 倍。

assay-validation-westernblot-comparison-total-p300（图示：总 p300 检测验证 11）

简化通路

CREBBP/p300 信号通路

转录共激活因子 CREBBP 和 p300 通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和 c-Myc、p53、FoxO1 等转录因子（TF）等其他转录调节因子进行乙酰化修饰，来调控基因表达。

CREBBP 和 p300 是多种重要信号通路（由细胞内或细胞外信号激活）的核心分子。它们调控生长因子和激素信号（如由雄激素受体 AR、雌激素受体 ER 介导的信号）；此外，还参与缺氧、细胞应激（涉及 p38、JNK、ERK 等 MAP 激酶）、高糖、G 蛋白偶联受体（GPCR）激动剂（诱导环磷腺苷 cAMP 信号）、细胞因子（由 JAK/STAT 通路介导）等信号的调控。同时，CREBBP/p300 还调控 TLR/IRF-3 通路，以控制先天免疫应答。在 BRD4 占据的位点（如 H3K27ac 修饰位点），CREBBP 和 p300 均为组蛋白乙酰化所必需；且二者对 BRD4 结合到基因启动子和增强子区域、调控相关基因转录也至关重要。

所有这些通路最终均以细胞核内的 CREBBP 和 p300 作为下游效应分子，调控细胞周期、细胞分化、胚胎发育、稳态等关键细胞功能。

pathway-total-p300-64p300tpeg-64p300tpeh-64p300tpey（图示：CREBBP/p300 信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格：10,000 次检测

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货号：64P300TPEH

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