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HTRF P62/SQSTM1 P-S403 KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述


这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒，可便捷、准确地定量检测丝氨酸 403（Ser403）位点磷酸化的 p62/SQSTM1 蛋白。p62/SQSTM1 是一种泛素结合蛋白，参与自噬调控。自噬是一种能够清除异常蛋白质或细胞器的细胞机制，在癌症、神经退行性疾病以及心血管疾病和感染性疾病中发挥作用。


p62/SQSTM1 可作为泛素化 cargo 蛋白与自噬体之间的桥梁，它既能直接与 cargo 蛋白结合，也能与参与自噬体形成的 LC3 蛋白结合。近年来研究发现，p62/SQSTM1 的激活与 ULK1 和 mTor 诱导的不同位点磷酸化相关，例如 Ser403 位点的磷酸化。


激活的自噬通路可促进 p62 相关泛素化 cargo 蛋白的降解。


工作原理

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测原理

Revvity 公司的磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测可特异性检测 Ser403 位点磷酸化的 p62 蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需使用凝胶、无需开展电泳或转膜操作。
该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白（不受蛋白磷酸化状态影响）。当蛋白发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估蛋白的磷酸化状态。


phospho-how-it-works-phospho-p62-s403-assay-principle（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测原理）

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至小体积检测板（可为 HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）后，加入磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。


phospho-p62-s403-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）双板检测方案）

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。


phospho-p62-s403-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）单板检测方案）


检测验证

未处理细胞中 p62/SQSTM1 的表达及 Ser403 位点磷酸化情况

将人源 HeLa 细胞、SH-SY5Y 细胞以及小鼠源 Neuro2a 细胞分别以每孔 100,000 个、120,000 个和 50,000 个细胞的密度接种于 96 孔板。


在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时后，弃去细胞培养基，加入 50 微升（µL）补充后的 4 号裂解缓冲液（1×）。


在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟后，按以下方式将裂解液转移至小体积检测微孔板：


  • 取 16 微升裂解液用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）；
  • 取 4 微升裂解液，再加入 12 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×），用于检测总 p62/SQSTM1。


最后，加入 4 微升磷酸化（Ser403）p62/SQSTM1 或总 p62/SQSTM1 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。


结果显示，本实验中所检测的未处理细胞系均能检测到 p62/SQSTM1 的表达，但仅在 Neuro2A 细胞中观察到其磷酸化水平升高。


除证明该检测可兼容人源和小鼠源样本外，这些结果还表明，p62/SQSTM1 的表达及磷酸化情况会因细胞背景不同而存在差异。


assay-validation-p62-phospho-s403-1（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 1）

巴弗洛霉素 A1（Bafilomycin A1）剂量效应

将人源 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以每孔 100,000 个和 120,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。


用浓度递增的巴弗洛霉素 A1（一种公认的自噬流抑制剂）孵育细胞过夜后，移除细胞培养基，加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×）裂解细胞。在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟后，按以下方式将裂解液转移至小体积检测微孔板：


  • 取 16 微升裂解液用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）；
  • 取 4 微升裂解液，再加入 12 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×），用于检测总 p62/SQSTM1。


最后，加入 4 微升磷酸化（Ser403）p62/SQSTM1 或总 p62/SQSTM1 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。


正如预期，随着巴弗洛霉素 A1 浓度的增加，p62/SQSTM1 的表达量及其 Ser403 位点磷酸化水平均呈剂量依赖性升高。


注：巴弗洛霉素 A1 的半数有效浓度（EC50）约为 20 纳摩尔（nM），且在 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞中的 EC50 值具有可比性。


assay-validation-p62-phospho-s403-2（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 2）


assay-validation-p62-phospho-s403-3（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 3）

HeLa 细胞饥饿处理 6 小时实验

将人源 HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种于 96 孔板。孵育 24 小时后，移除细胞培养基，分别加入 EBSS 培养基（一种不含氨基酸和维生素的培养基）或新鲜培养基，继续培养 6 小时。


随后，加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×）裂解细胞。在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟后，按以下方式将裂解液转移至小体积检测微孔板：


  • 取 16 微升裂解液用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）；
  • 取 4 微升裂解液，再加入 12 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×），用于检测总 p62/SQSTM1。


最后，加入 4 微升磷酸化（Ser403）p62/SQSTM1 或总 p62/SQSTM1 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。


正如预期，氨基酸缺乏条件下，总 p62/SQSTM1 水平降低，这是自噬诱导降解机制作用的结果。


assay-validation-p62-phospho-s403-4（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 4）

PP242 剂量效应

将人源 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以每孔 100,000 个和 120,000 个细胞的密度接种于 96 孔板。


用浓度递增的自噬诱导剂 PP242 处理细胞（HeLa 细胞处理 6 小时；SH-SY5Y 细胞处理过夜）后，移除培养基。


随后，加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×）裂解细胞。在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟后，按以下方式将裂解液转移至小体积检测微孔板：


  • 取 16 微升裂解液用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）；
  • 取 4 微升裂解液，再加入 12 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1×），用于检测总 p62/SQSTM1。


最后，加入 4 微升磷酸化（Ser403）p62/SQSTM1 或总 p62/SQSTM1 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。


结果显示，经 PP242 处理后，p62/SQSTM1 水平降低，这是自噬通路诱导降解作用的结果。


assay-validation-p62-phospho-s403-5（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 5）


assay-validation-p62-phospho-s403-6（图示：磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测验证 6）

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）细胞检测：HTRF 法与蛋白质印迹法比较

将人源 HeLa 细胞培养 2 天，直至融合度达到 80%。随后用 4 微摩尔（µM）MG-132 刺激细胞过夜，再用补充后的裂解缓冲液裂解细胞，通过离心收集可溶性上清液。


用补充后的 4 号裂解缓冲液（1×）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 HTRF 小体积检测微孔板，再加入 4 微升磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）HTRF 检测试剂。


通过蛋白质印迹法与 HTRF 法的平行对比检测表明，至少在本实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。


简化通路

p62/SQSTM1 检测相关简化通路

自噬是一种生理性细胞过程，能够清除错误折叠或聚集的蛋白质，以及受损的细胞器（如线粒体，该过程也称为线粒体自噬）。自噬通路可在氧化应激、营养缺乏、感染（异体自噬）以及癌症或神经退行性疾病发生发展过程中被激活，其依赖 p62/SQSTM1、ATG 蛋白、LC3 等关键分子发挥作用。


p62/SQSTM1 是一种衔接蛋白，首先由 ULK1 在丝氨酸 407（Ser407）位点磷酸化，随后由酪蛋白激酶 2（casein kinase 2）或 TBK1 在丝氨酸 403（Ser403）位点磷酸化。Ser403 位点的磷酸化会增强 p62/SQSTM1 与泛素链的亲和力，使其能够结合泛素化 cargo 蛋白。与 p62/SQSTM1 结合的泛素化蛋白或泛素包裹的线粒体被吞噬体吞噬，吞噬体与溶酶体融合后，其内容物被清除。


此外，研究发现，在氧化应激或氨基酸缺乏条件下，p62/SQSTM1 的丝氨酸 349（Ser349）位点也会发生磷酸化。该磷酸化事件会破坏 Keap1 与转录因子 Nrf2 之间的相互作用，使 Nrf2 转移至细胞核内，激活包括 p62/SQSTM1 在内的抗氧化基因的转录。同时，细胞质中的 Keap1 会被 p62/SQSTM1 捕获，并通过自噬清除机制降解。


除 p62/SQSTM1 在介导异常 cargo 进入自噬清除过程中的作用外，自噬过程还需要其他关键组分参与，其中包括 ULK1 复合物、VSP34 复合物，以及由 ATG 蛋白家族和 LC3-II 组成的结合机制 —— 这些组分依次参与吞噬泡的形成。吞噬泡进一步发展为自噬体，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，蛋白酶、磷酸酶等酶类在自噬溶酶体内发挥活性作用。


phospho-pathway-p62-sqstm1-phospho-s403-64p62s4peg（图示：p62/SQSTM1（Ser403 磷酸化）简化通路）


规格参数


其他规格参数

  • 应用领域：细胞信号通路研究
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
  • 分子修饰类型：磷酸化
  • 产品类别：试剂盒
  • 样本体积：16 微升
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶点类别：磷酸化蛋白
  • 靶点物种：人、小鼠
  • 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
  • 治疗领域：心血管疾病、感染性疾病、神经科学、肿瘤学与炎症
  • 单位规格：500 次检测


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货号：64P62S4PEG
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