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HTRF P62/SQSTM1 P-S403 KIT - 50K PTS

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概述

这款基于 HTRF 的细胞检测试剂盒能够便捷、准确地定量 Ser403 位点磷酸化的 p62/SQSTM1。p62/SQSTM1 是一种泛素结合蛋白，参与自噬调控。自噬是一种能够清除异常蛋白质或细胞器的细胞机制，在癌症、神经退行性疾病以及心血管疾病和传染病中发挥作用。

p62/SQSTM1 通过直接与泛素化的 cargo 蛋白和参与自噬体形成的 LC3 蛋白相互作用，充当泛素化 cargo 蛋白与自噬体之间的桥梁。最近研究表明，p62/SQSTM1 的激活与 ULK1 和 mTor 诱导的不同位点（如 Ser403）磷酸化相关。

激活的自噬通路会促进 p62 相关的泛素化蛋白 cargo 的降解。

工作原理

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测原理

Revvity 的磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测用于测量在 Ser403 位点发生磷酸化的 p62。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 p62（Ser403）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移到小体积检测板（HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）中，再加入 HTRF 磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

未处理细胞中 p62/SQSTM1 的表达及 Ser403 位点磷酸化情况

人 HeLa 细胞、SH-SY5Y 细胞和小鼠 Neuro2a 细胞分别以 100,000 个、120,000 个和 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，弃去细胞培养基，加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。

在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示，在本实验评估的未处理细胞系中，p62/SQSTM1 均有表达，但其磷酸化水平仅在 Neuro2A 细胞中升高。

除了证明该检测与人和小鼠样本的兼容性外，这些结果还表明 p62/SQSTM1 的行为因细胞背景不同而存在差异。

巴佛洛霉素 A1 的剂量反应

人 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以 100,000 个和 120,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

用不同浓度的巴佛洛霉素 A1（一种公认的自噬流阻断剂）孵育过夜后，移除细胞培养基，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，随着巴佛洛霉素 A1 浓度的增加，p62/SQSTM1 的表达及其 S403 位点的磷酸化均呈剂量依赖性增加。

注意，巴佛洛霉素的半数有效浓度（EC50）约为 20nM，且在 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞中相当。

HeLa 细胞饥饿 6 小时实验

人 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。孵育 24 小时后，移除细胞培养基，更换为 EBSS（一种不含氨基酸和维生素的培养基）或新鲜培养基，持续 6 小时。

随后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，氨基酸缺乏条件下总 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬诱导的降解机制导致的。

PP242 的剂量反应

人 HeLa 细胞和 SH-SY5Y 细胞分别以 100,000 个和 120,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。

用不同浓度的自噬诱导剂 PP242 处理细胞（HeLa 细胞处理 6 小时；SH-SY5Y 细胞处理过夜）后，移除培养基。

随后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将裂解物按以下方式转移到小体积检测微孔板中：

16µL 裂解物用于检测磷酸化 p62/SQSTM1（S403）
4µL 裂解物，再加入 12µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）用于检测总 p62/SQSTM1

最后，加入 4µL HTRF 磷酸化（Ser403）或总 p62/SQSTM1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，PP242 处理后 p62/SQSTM1 水平降低，这是由自噬通路诱导的降解导致的。

基于 HTRF 的磷酸化 p62/SQSTM1（Ser403）细胞检测与蛋白质印迹法的比较

人 HeLa 细胞培养 2 天，直至达到 80% 汇合度。然后用 MG-132（4µM）刺激过夜，再用补充的裂解缓冲液裂解，通过离心收集可溶性上清液。

用补充的 4 号裂解缓冲液（1X）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 裂解物转移到 HTRF 小体积检测微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 p62/SQSTM1（S403）检测试剂。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

p62/SQSTM1 检测的简化通路

自噬是一种生理性细胞过程，能够清除错误折叠或聚集的蛋白质，以及受损的细胞器（如线粒体，也称为线粒体自噬）。自噬通路在氧化应激、营养缺乏、感染（异源自噬）时被激活，在癌症或神经退行性疾病发展过程中也会被激活，它依赖于 p62/SQSTM1、ATG 蛋白、LC3 等关键分子。

p62/SQSTM1 是一种衔接蛋白，首先被 ULK1 在 Ser407 位点磷酸化，然后被酪蛋白激酶 2 或 TBK1 在 Ser403 位点磷酸化。Ser403 位点的磷酸化会增强其与泛素链的亲和力，从而使 p62/SQSTM1 能够结合泛素化的 cargo 蛋白。与 p62/SQSTM1 结合的泛素化蛋白或泛素包被的线粒体被吞噬体吞噬，吞噬体内容物在与溶酶体融合后被清除。

此外，已有研究报道，在氧化应激或氨基酸缺乏时，p62/SQSTM1 的 Ser349 位点会发生磷酸化。这种磷酸化会破坏 Keap1 与转录因子 Nrf2 之间的相互作用，使 Nrf2 转移到细胞核中，激活包括 p62/SQSTM1 在内的抗氧化基因的转录。同时，细胞质中的 Keap1 会被 p62/SQSTM1 捕获，并通过自噬清除被降解。

除了 p62/SQSTM1 在将不需要的 cargo 导向自噬清除中的作用外，自噬过程还需要其他成分。其中包括 ULK1 和 VSP34 复合物，以及由 ATG 蛋白家族和 LC3-II 组成的 conjugation 机制，它们依次参与吞噬泡的形成。吞噬泡会发展为自噬体，自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体，蛋白酶或磷酸酶等酶在自溶酶体中发挥作用。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、传染病、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64P62S4PEY

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