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HTRF (H) PINK1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

Total PINK1 检测试剂盒旨在监测细胞内 PINK1 蛋白的水平。

PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在 PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬中发挥关键作用。该信号通路对于清除有毒线粒体产物、维持细胞稳态至关重要。此信号通路的调控异常与神经退行性疾病相关，其中以帕金森病最为主要。

在线粒体受损 depolarization（去极化）时，PINK1 会在线粒体外膜上积累，并通过磷酸化两种底物激活 PINK1-Parkin 通路：一种是 Parkin 的类泛素结构域，另一种是位于 Ser65 位点的泛素链。Parkin 是一种泛素连接酶 E3，可将泛素偶联到受损线粒体蛋白上，进而导致线粒体降解。PINK1/Parkin 依赖性泛素功能的增强可作为信号，介导受损线粒体的隔离与降解（即线粒体自噬）。

使用解偶联剂（如 CCCP 和缬氨霉素）使线粒体去极化，会导致 PINK1 在线粒体外膜上积累，并触发磷酸化 Ser65 - 泛素的产生。

检测原理

Total PINK1 检测原理

HTRF Total PINK1 检测试剂盒通过细胞裂解液对 PINK1 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。Total PINK1 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 PINK1 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 PINK1 时，加入上述偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 PINK1 蛋白的浓度直接相关，且可通过 “无需洗涤” 的检测模式评估该蛋白的表达水平。

Total PINK1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解，再将裂解液转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入 Total PINK1 HTRF 检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。

Total PINK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Total PINK1 可在单个培养板中完成，该培养板可同时用于细胞培养、刺激处理和裂解操作，无需洗涤步骤。此方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现微型化检测的同时，保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

CCCP 诱导 SH-SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH-SY5Y 细胞（神经母细胞瘤细胞）或 PC3 细胞（前列腺腺癌细胞）以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用浓度递增的线粒体解偶联剂 —— 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞。孵育 6 小时后，去除细胞培养基，向每孔中加入 50 微升添加了补充剂的 1× 裂解缓冲液 #1。细胞裂解后，将 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 微升 HTRF Total PINK1 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

同时，取 4 微升 1:5 稀释的裂解液，采用 HTRF Alpha-Tubulin 内参检测试剂盒（64ATUBPEG/H）进行检测，作为标准化工具。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

在两种细胞系中，CCCP 均可诱导 PINK1 蛋白水平呈剂量依赖性增加。这些结果表明，CCCP 可诱导 PINK1 积累，其预期半数有效浓度（EC50）处于低微摩尔（µM）范围。

缬氨霉素诱导 SH-SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH-SY5Y 细胞（神经母细胞瘤细胞）或 PC3 细胞（前列腺腺癌细胞）以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用浓度递增的线粒体解偶联剂 —— 缬氨霉素处理细胞。孵育 4 小时后，去除细胞培养基，向每孔中加入 50 微升添加了补充剂的 1× 裂解缓冲液 #1。细胞裂解后，将 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 微升 HTRF Total PINK1 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

同时，取 4 微升 1:5 稀释的裂解液，采用 HTRF Alpha-Tubulin 内参检测试剂盒（64ATUBPEG/H）进行检测，作为标准化工具。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

在两种细胞系中，缬氨霉素均可诱导 PINK1 蛋白水平呈剂量依赖性增加。这些结果表明，缬氨霉素可诱导 PINK1 积累，其预期半数有效浓度（EC50）处于纳摩尔（nM）范围。

简化通路

PINK1 信号通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，PINK1（PTEN 诱导激酶 1）会在受损的线粒体外膜（OMM）上积累，并通过二聚化和自身磷酸化被激活。激活后的 PINK1 会磷酸化泛素连接酶 Parkin（磷酸化位点为其类泛素结构域的 Ser65），以及线粒体外膜上的泛素化底物。TOM20 便是这些底物之一，其被泛素化后会被送往蛋白酶体降解。PINK1/Parkin 通路的激活会导致 PINK1 蛋白、磷酸化泛素（Ser65）积累，同时使 TOM20 水平降低。

PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬可确保清除有毒线粒体产物，从而防止神经元丢失。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰类型：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒（Kit）
样品体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白（Phosphoproteins）
靶标物种：人（Human）
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64PINKTPEH

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