当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H) PINK1 TOTAL KIT - 50K PTS

HTRF (H) PINK1 TOTAL KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64PINKTPEG_US rvty_ls_sds_64PINKTPEG_UK rvty_ls_sds_64PINKTPEG_SPA rvty_ls_sds_64PINKTPEG_ITA rvty_ls_sds_64PINKTPEG_ELL rvty_ls_sds_64PINKTPEG_DEU rvty_ls_sds_64PINKTPEG_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

总 PINK1 检测试剂盒旨在监测细胞内 PINK1 蛋白的水平。

PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在 PINK1 - Parkin 介导的线粒体自噬中发挥关键作用。该信号通路对于清除有毒的线粒体产物、维持细胞内稳态至关重要。此信号通路的失调与神经退行性疾病相关，主要是帕金森病。

在受损的去极化线粒体中，PINK1 会在 mitochondria 外膜积累，并通过磷酸化两个底物（Parkin 的泛素样结构域和 Ser65 位的泛素链）激活 PINK1 - Parkin 通路。Parkin 是一种泛素连接酶 E3，它能将泛素偶联到受损的线粒体蛋白上，进而导致细胞器降解。经放大的 PINK1/Parkin 依赖性泛素功能可作为受损线粒体隔离和降解（线粒体自噬）的信号。

解偶联剂（如 CCCP 和缬氨霉素）引起的线粒体去极化，会导致 PINK1 在线粒体外膜积累，并触发磷酸化 Ser65 - 泛素的产生。

工作原理

总 PINK1 检测原理

HTRF 总 PINK1 检测可定量细胞裂解物中 PINK1 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 PINK1 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 PINK1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

assay - principle - total - pink1 - 64pinktpeg（总 PINK1 检测原理）

总 PINK1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 PINK1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 PINK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 PINK1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

CCCP 诱导 SH - SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH - SY5Y（神经母细胞瘤）或 PC3（前列腺腺癌）细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用不同浓度的线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞。孵育 6 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 PINK1 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

同时，对 1/5 稀释的裂解物取 4µL 进行 HTRFα - 微管蛋白内参检测（64ATUBPEG/H），作为归一化工具。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在这两种细胞中，CCCP 化合物均引发 PINK1 蛋白水平呈剂量依赖性增加。这些结果表明，CCCP 诱导 PINK1 积累，其预期半数有效浓度（EC50）在低微摩尔范围内。

缬氨霉素诱导 SH - SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH - SY5Y（神经母细胞瘤）或 PC3（前列腺腺癌）细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用不同浓度的线粒体解偶联剂缬氨霉素处理细胞。孵育 4 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 PINK1 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

同时，对 1/5 稀释的裂解物取 4µL 进行 HTRFα - 微管蛋白内参检测（64ATUBPEG/H），作为归一化工具。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在这两种细胞中，缬氨霉素化合物均引发 PINK1 蛋白水平呈剂量依赖性增加。这些结果表明，缬氨霉素诱导 PINK1 积累，其预期半数有效浓度（EC50）在纳摩尔范围内。

简化通路

PINK1 信号通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，PINK1（PTEN 诱导激酶 1）会在受损的线粒体外膜（OMM）积累，并通过二聚化和自身磷酸化被激活。激活后的 PINK1 会磷酸化泛素连接酶 Parkin（在其泛素样结构域的 Ser65 位）以及线粒体外膜上的泛素化底物。其中包括 TOM20，它一旦被泛素化就会被送往蛋白酶体。PINK1/Parkin 通路的激活会导致 PINK1 蛋白、磷酸化泛素（Ser65）积累，以及 TOM20 水平降低。

PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬确保清除有毒的线粒体产物，防止神经元丢失。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64PINKTPEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价