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HTRF PLCG1 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒可便捷、准确地检测磷脂酶 Cγ1（PLCγ1）蛋白。

PLCγ1 是一种磷酸肌醇特异性磷脂酶，能够产生第二信使，在信号转导中发挥关键作用。细胞受到刺激后，PLCγ1 会与酪氨酸激酶受体及 T 细胞受体等其他分子相互作用，通过酪氨酸 783（Tyr783）位点的磷酸化被激活。

PLCγ1 是多种疾病中的潜在靶点。例如，有研究表明，血管肉瘤和 T 细胞淋巴瘤中常出现 PLCG1 基因突变，且其激活还与乳腺癌的扩散相关。

工作原理

总 PLCγ1（Total-PLCγ1）检测原理

总 PLCγ1 检测可对细胞裂解液中 PLCγ1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。总 PLCγ1 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 PLCγ1 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 PLCγ1 时，加入上述偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 PLCγ1 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “无需洗涤” 的检测模式评估该蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-total-plcgamma1-assay-principle（图示：总 PLCγ1 检测原理）

总 PLCγ1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 PLCγ1 HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-total-plcgamma1-2-plate-assay-protocol（图示：总 PLCγ1 双板检测方案）

总 PLCγ1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 PLCγ1 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

phospho-how-it-works-total-plcgamma1-1-plate-assay-protocol（图示：总 PLCγ1 单板检测方案）

检测验证

抗 CD3 抗体刺激 Jurkat T 细胞后 PLCγ1 的激活检测

将人 Jurkat T 细胞系以每孔 200,000 个细胞的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔加入 25 微升完全培养基。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 3 小时后，向每孔加入 5 微升浓度递增的 CD3 抗体刺激细胞 2 分钟，随后加入 10 微升补充后的 3 号裂解缓冲液（4×），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化 PLCγ1（Tyr783）或总 PLCγ1 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，抗 CD3 抗体可诱导 PLCγ1 的 Tyr783 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白表达水平未发生改变，这表明细胞表面的 T 细胞受体（TCR）复合物被激活。

assay-validation-total-plcgamma1-1（图示：总 PLCγ1 检测验证 1）

表皮生长因子（EGF）刺激 A431 细胞后 PLCγ1 的激活检测

将人 A431 细胞系以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50 微升完全培养基。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，向每孔加入 50 微升浓度递增的 EGF 刺激细胞 5 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案对磷酸化 PLCγ1 和总 PLCγ1 进行检测。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，EGF 可诱导 PLCγ1 的 Tyr783 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体 —— 表皮生长因子受体（EGFR）被激活。

assay-validation-total-plcgamma1-2（图示：总 PLCγ1 检测验证 2）

血小板衍生生长因子 - BB（PDGF-BB）刺激 NIH-3T3 细胞后 PLCγ1 的激活检测

将小鼠 NIH-3T3 细胞系以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50 微升完全培养基。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，向每孔加入 50 微升浓度递增的 PDGF-BB 刺激细胞 30 分钟。

裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案对磷酸化 PLCγ1 和总 PLCγ1 进行检测。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，PDGF-BB 可诱导 PLCγ1 的 Tyr783 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体 —— 血小板衍生生长因子受体（PDGFR）被激活。

assay-validation-total-plcgamma1-3（图示：总 PLCγ1 检测验证 3）

磷酸化 PLCγ1（Tyr783）HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人 Jurkat T 细胞系在含完全培养基的 T175 培养瓶中，于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。离心后，用 5 微克 / 毫升的抗 CD3 抗体刺激细胞 pellet（细胞沉淀）2 分钟。随后加入 3 号裂解缓冲液（2×），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升总 PLCγ1 HTRF 检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与 HTRF 法进行平行对比检测。

结果显示，使用总 PLCγ1 HTRF 检测时，每孔仅需 1000 个细胞即可检测到显著信号；而采用蛋白质印迹法时，需 8000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在此实验条件下，磷酸化 PLCγ1 HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

assay-validation-total-plcgamma1-4（图示：总 PLCγ1 检测验证 4）

简化通路

PLCγ1 信号通路简化图

PLCγ1（磷脂酶 Cγ1）是一种胞质酪氨酸激酶，在受体型或非受体型酪氨酸激酶的信号转导中发挥关键作用。

T 细胞受到刺激后，Src 家族蛋白会使 T 细胞抗原受体（TCR）上的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）磷酸化。磷酸化的 ITAM 会招募 ZAP-70 和 SLP-76，这两种分子与 PLCγ1 结合后，会通过磷酸化 PLCγ1 催化结构域的 Tyr783 位点使其激活。

此外，受体酪氨酸激酶激活后，会通过与 PLCγ1 N 端 SH2 结构域的结合，招募 PLCγ1 至细胞膜，进而诱导 PLCγ1 的 Tyr783 位点磷酸化。

phospho-pathway-plcgamma1-total-kit-64plcg1tpeg（图示：PLCγ1 信号通路简化图）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 次检测

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货号：64PLCG1TPEG

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