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HTRF PLCG1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够便捷且准确地检测磷脂酶 Cγ1（PLCγ1）蛋白。

PLCγ1 是一种磷酸肌醇特异性磷脂酶，它能生成第二信使，在信号转导中发挥关键作用。当细胞受到刺激时，PLCγ1 会与酪氨酸激酶受体以及 T 细胞受体等其他物质相互作用，通过在酪氨酸 783（Tyr783）位点发生磷酸化而被激活。

PLCγ1 在多种疾病中是潜在的治疗靶点。例如，已有研究报道在血管肉瘤和 T 细胞淋巴瘤中，PLCG1 基因频繁发生突变，且其激活还与乳腺癌的扩散有关。

工作原理
总 PLCγ1 检测原理
总 PLCγ1 检测可对细胞裂解物中 PLCγ1 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全在微孔板上进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 PLCγ1 检测使用两种标记抗体，一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 PLCγ1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测格式下，为评估蛋白质的表达提供了一种方法。

总 PLCγ1 双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 PLCγ1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 PLCγ1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 PLCγ1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
抗 CD3 刺激的 Jurkat T 细胞中 PLCγ1 的激活
将人 Jurkat T 细胞系以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到半面积 96 孔培养处理板中，每孔加入 25μL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时后，用 5μL 不同浓度递增的 CD3 抗体刺激细胞 2 分钟，然后加入 10μL 补充的 3 号裂解缓冲液（4 倍浓度），在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。在检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）或总 PLCγ1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

抗 CD3 抗体诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的 T 细胞受体（TCR）复合物被激活。

表皮生长因子（EGF）刺激的 A431 细胞中 PLCγ1 的激活
将人 A431 细胞系以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50μL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，用 50μL 不同浓度递增的 EGF 刺激细胞 5 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案对磷酸化的 PLCγ1 和总 PLCγ1 进行检测。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

EGF 诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体表皮生长因子受体（EGFR）被激活。

血小板衍生生长因子 - BB（PDGF - BB）刺激的 NIH - 3T3 细胞中 PLCγ1 的激活
将小鼠 NIH - 3T3 细胞系以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50μL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，用 50μL 不同浓度递增的 PDGFR - BB 刺激细胞 30 分钟。

裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案对磷酸化的 PLCγ1 和总 PLCγ1 进行检测。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

PDGFR - BB 诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体血小板衍生生长因子受体（PDGFR）被激活。

HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测与蛋白质印迹法的比较
将人 Jurkat T 细胞系在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。离心后，用 5μg/mL 的抗 CD3 抗体刺激沉淀细胞 2 分钟。然后加入 2 号裂解缓冲液（2 倍浓度），在室温下轻轻振荡 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 总 PLCγ1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 PLCγ1 检测时，每孔 1,000 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 8,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 PLCγ1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路
PLCγ1 信号传导的简化通路
PLCγ1（磷脂酶 Cγ1）是一种胞质酪氨酸激酶，在受体或非受体酪氨酸激酶的信号转导中起着至关重要的作用。

当 T 细胞受到刺激时，Src 家族蛋白会使 T 细胞抗原受体（TCR）上的基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAMs）磷酸化。磷酸化的 ITAMs 会招募 ZAP - 70 和 SLP - 76，它们与 PLCγ1 结合，通过使其 Tyr783 催化结构域磷酸化而激活 PLCγ1。

另外，受体酪氨酸激酶的激活会通过 PLCγ1 的 N 端 SH2 结构域与膜结合，从而诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点发生磷酸化。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样品体积
16μL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸化蛋白
靶标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

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货号：64PLCG1TPEY

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