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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地检测磷脂酶 Cγ2（PLCγ2）蛋白。

PLCγ2 是一种磷酸肌醇特异性磷脂酶，可产生第二信使，在信号转导中发挥关键作用，尤其在造血细胞中，如 B 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和血小板。当 B 细胞抗原受体（BCR）和 Fc 受体（FcRs）等不同受体受到刺激时，PLCγ2 会与多种衔接蛋白相互作用，并被细胞内酪氨酸激酶磷酸化。磷酸化涉及多个位点，其中之一是 Tyr1217。

PLCγ2 与多种疾病相关，如自身免疫性疾病、炎症性疾病、癌症中的耐药性以及神经退行性疾病。

工作原理

总 PLCγ2 检测原理

总 PLCγ2 检测可量化细胞裂解物中 PLCγ2 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 PLCγ2 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 PLCγ2 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测格式中即可评估蛋白质的表达。

总 PLCγ2 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 PLCγ2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 PLCγ2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 PLCγ2 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

抗 IgM 刺激的 Ramos B 细胞中 PLCγ2 的激活

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔含 25μL 无胎牛血清（FBS）的培养基。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时后，用 5μL 不同浓度的抗人 IgM 抗体刺激细胞 5 分钟，然后加入 10μL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 PLCγ2（Tyr1217）或总 PLCγ2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

抗人 IgM 抗体诱导了 PLCγ2 在 Tyr1217 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生变化，这表明细胞表面的 BCR 复合物被激活。

Ramos 细胞和 THP-1 细胞中的细胞密度

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系和单核细胞 THP-1 细胞系接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔含 30μL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时后，加入 10μL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 PLCγ2（Tyr1217）或总 PLCγ2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

Ramos 细胞中总 PLCγ2 的表达量是 THP-1 细胞的两倍。

HTRF 总 PLCγ2 检测与蛋白质印迹法的比较

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。离心后，用 20μg/mL 的抗人 IgM 抗体刺激沉淀细胞 5 分钟。然后加入 2X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 总 PLCγ2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 PLCγ2 检测时，每孔 1,000 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 2,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 PLCγ2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。

简化通路

PLCγ2 信号传导的简化通路

PLCγ2（磷脂酶 Cγ2）是一种胞质酪氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞和小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）。

当 B 细胞或 TREM2/DAP12 受体复合物受到刺激时，PLCγ2 会与 SYK、BTK 和 BLNK（也称为 SLP-65）相互作用，通过其催化结构域在 Tyr1217 位点的磷酸化而被激活。然后，PLCγ2 会将磷脂酰肌醇 4,5 - 二磷酸（PIP2）切割为二酰基甘油（DAG）和肌醇 1,4,5 - 三磷酸（IP3）。IP3 随后会促进钙释放并降解为 IP1。

这将触发多种信号通路的激活和细胞反应，包括细胞激活、增殖和存活。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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HTRF PLCG2 TOTAL KIT - 50K PTS

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