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HTRF PLCG2 P-Y1217 KIT - 10K PTS

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光检测试剂盒可便捷、准确地检测酪氨酸 1217 位点磷酸化的磷脂酶 Cγ2。

磷脂酶 Cγ2 是一种磷酸肌醇特异性磷脂酶，能够生成第二信使，在信号转导中发挥关键作用，尤其在造血细胞中，如 B 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和血小板。当 B 细胞抗原受体、Fc 受体等不同受体受到刺激时，磷脂酶 Cγ2 会与多种衔接蛋白相互作用，并被细胞内酪氨酸激酶磷酸化。磷酸化发生在多个位点，其中之一便是酪氨酸 1217。

磷脂酶 Cγ2 与多种疾病相关，例如自身免疫性疾病、炎症性疾病、癌症中的耐药性以及神经退行性疾病。

工作原理

磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）检测原理

磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）检测可对酪氨酸 1217 位点磷酸化的磷脂酶 Cγ2 进行定量检测。与蛋白质印迹法不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。检测过程中使用两种抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质（不受蛋白质磷酸化状态影响）。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在免洗涤检测模式下，可用于评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-plcgamma2-assay-principle（图示：磷酸化磷脂酶 Cγ2 检测原理）

磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后对细胞进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-plcgamma2-y1217-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）双板检测方案）

磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-plcgamma2-y1217-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）单板检测方案）

检测验证

抗免疫球蛋白 M 抗体刺激拉莫斯 B 细胞后磷脂酶 Cγ2 的激活检测

将人 B 细胞淋巴瘤拉莫斯细胞系以每孔 40 万个细胞的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔加入 25 微升完全培养基。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 3 小时后，向每孔加入 5 微升浓度递增的抗人免疫球蛋白 M 抗体刺激细胞 5 分钟，随后加入 10 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（4 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）或总磷脂酶 Cγ2 均相时间分辨荧光检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示，抗人免疫球蛋白 M 抗体可诱导磷脂酶 Cγ2 的酪氨酸 1217 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质表达水平未发生改变，这表明细胞表面的 B 细胞抗原受体复合物被激活。

assay-validation-plc-gamma2-phospho-y1217-1（图示：磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）检测验证 1）

磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将人 B 细胞淋巴瘤拉莫斯细胞系在含完全培养基的 T175 培养瓶中，于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。离心后，用 20 微克 / 毫升的抗人免疫球蛋白 M 抗体刺激细胞沉淀 5 分钟。随后加入 4 号裂解缓冲液（2 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。

结果显示，使用磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）均相时间分辨荧光检测时，每孔仅需 4000 个细胞即可检测到显著信号；而采用蛋白质印迹法时，需 8000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在此实验条件下，磷酸化磷脂酶 Cγ2 均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

assay-validation-plc-gamma2-phospho-y1217-2（图示：磷酸化磷脂酶 Cγ2（酪氨酸 1217）检测验证 2）

简化通路

磷脂酶 Cγ2 信号通路简化图

磷脂酶 Cγ2 是一种胞质酪氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞和小胶质细胞（脑内常驻巨噬细胞）。

当 B 细胞或髓系细胞触发受体 2/DNAX 激活蛋白 12 受体复合物受到刺激时，磷脂酶 Cγ2 会与脾酪氨酸激酶、布鲁顿酪氨酸激酶和 B 细胞链接蛋白（也称为 SLP-65）相互作用，通过其催化结构域的酪氨酸 1217 位点磷酸化而被激活。随后，磷脂酶 Cγ2 会将磷脂酰肌醇 4,5 - 二磷酸裂解为二酰甘油和肌醇 1,4,5 - 三磷酸。肌醇 1,4,5 - 三磷酸进而会促进钙释放，并将自身降解为肌醇 1 - 磷酸。

这一过程会触发多种信号通路的激活和细胞反应，包括细胞激活、增殖和存活。

pathway-plcgamma2-phospho-y1217-kit-64plcg2y7peg（图示：磷脂酶 Cγ2 信号通路简化图）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光
检测方式：均相时间分辨荧光
裂解缓冲液兼容性：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移
治疗领域：神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：10000 次检测

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货号：64PLCG2Y7PEH

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