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当前位置:首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H/M) PLK1 P-T210 KIT - 50K PTS

概述


这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测在苏氨酸 210(Threonine 210)位点磷酸化的 Polo 样激酶 1(PLK1)。Polo 样激酶 1(PLK1)是高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族的主要成员,对细胞分裂(有丝分裂)至关重要。因此,它是细胞周期中 G2/M 检查点的关键调节因子。


细胞周期调控中的 PLK1 激活:PLK1 通过 AurA 激酶在 Thr210 位点的磷酸化而被激活。激活的 PLK1 会磷酸化 CDC25。


PLK1 是负责有丝分裂和细胞周期进程 / 细胞增殖的关键蛋白质。这使它成为一个极具吸引力的癌症治疗靶点。


工作原理
磷酸化 PLK1(Thr210)检测原理
HTRF 磷酸化 PLK1(Thr210)检测可测量在 Thr210 位点磷酸化的 PLK1。与蛋白质印迹法(Western Blot)不同,该检测完全基于微孔板,不需要凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 PLK1(Thr210)检测使用两种标记抗体:一种带有供体荧光团,另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序,第二种抗体则能够不依赖于蛋白质的磷酸化状态而识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物,使供体荧光团与受体荧光团靠近,从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比,并且提供了一种在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质磷酸化状态的方法。


磷酸化 PLK1(Thr210)双板检测方案
双板方案包括在 96 孔板中培养细胞,然后裂解细胞,接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中,之后再加入磷酸化 PLK1(Thr210)HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


磷酸化 PLK1(Thr210)单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 PLK1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。


这种为高通量筛选(HTS)设计的方案能够实现小型化,同时保持稳定的 HTRF 质量。


检测验证
在 HeLa 细胞中测量总 PLK1 和磷酸化 PLK1 Thr210 的激活情况
将 HeLa 细胞以 20,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中,使用完全培养基,在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。然后用不同浓度的诺考达唑(Nocodazole)处理细胞,在 37°C、5% CO₂条件下处理 16 小时。接下来,用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


细胞裂解后,将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中,并加入 4 µL HTRF 总 PLK1 或磷酸化 PLK1 Thr210 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。


如预期所示,诺考达唑以剂量依赖的方式诱导 PLK1 的表达和磷酸化增加,半数有效浓度(EC50)约为 60-70 nM。


在 HeLa 细胞上使用磷酸化 PLK1(Thr210)和总 PLK1 进行抑制剂表征
将表达 PLK1 的 HeLa 细胞以 20,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中,使用完全培养基,在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。然后用 200 nM 诺考达唑和不同浓度的 PLK1 激活剂阿霉素(Doxorubicin)、两种 AuroraA 抑制剂 MLN8054 和阿利塞替(Alisertib)以及 PROTAC 化合物 CC885 共同处理细胞,在 37°C、5% CO₂条件下处理 16 小时。接下来,移除培养基,用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


细胞裂解后,将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中,并加入 4 µL HTRF 磷酸化 PLK1 Thr210 和总 PLK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


如预期所示,所有这些化合物都会导致 PLK1 磷酸化水平降低,但半数有效浓度(EC50)不同:阿霉素为 54 nM,MLN8054 约为 6 µM,阿利塞替为 28 nM,PROTAC CC885 为 68 nM。


有趣的是,除 MLN8054 外,所有化合物都以相同的方式降低了 PLK1 的表达。


在各种人类和小鼠细胞系上的验证
将贴壁的人类和小鼠细胞(HeLa、MCF7、Hep-G2 和 NIH 3T3)以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后,用 300 nM 诺考达唑在 37°C 条件下处理细胞 16 小时。然后用补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞,将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中,之后加入 4 µL HTRF 磷酸化 PLK1 Thr210 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


HTRF 磷酸化 PLK1 Thr210 检测能够在表达不同水平该蛋白质的各种细胞模型中有效检测磷酸化的 PLK1。


HTRF 磷酸化 PLK1(Thr210)检测与蛋白质印迹法的比较
将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基培养,在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 300 nM 诺考达唑化合物在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时。然后用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释,将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中,然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 Thr210 PLK1 检测试剂。


使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。


在这些条件下,HTRF 磷酸化 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。


简化通路
PLK1 信号通路
Polo 样激酶 1(PLK1)在有丝分裂进程中起关键作用,最近的证据表明它在调节 G2/M 检查点、DNA 损伤和复制应激反应以及细胞死亡通路中也具有重要作用。其信号机制相当复杂,涉及多个正反馈环(Bora/AuroraA 通路)和负反馈环(CHK1/ATR 或 CHK2/ATM 通路)。细胞周期调控中的 PLK1 激活:PLK1 通过 AurA 激酶在 Thr210 位点的磷酸化而被激活。然后,激活的 PLK1 会磷酸化 CDC25。在自噬 / 凋亡中,PLK1 通过多种信号通路(包括 mTOR、c-myc 和 p53)参与各种细胞死亡过程。最近,文献报道了 PLK1 的新作用,即它参与炎症和免疫反应的调节,包括 NFκB 和 RIG-I/MAV 信号通路。所有这些生物学过程在肿瘤中都会发生改变,并且考虑到 PLK1 在几种肿瘤类型中经常被发现过表达,这种过表达与患者预后不良相关。因此,靶向 PLK1 已成为一种有前景的抗癌治疗策略。


规格


其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
裂解缓冲液兼容性
裂解缓冲液 1
裂解缓冲液 2
裂解缓冲液 4
分子修饰
磷酸化
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷酸化蛋白质
目标物种
人类
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
单位规格
500 个检测点


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