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HTRF (H) PLK1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒可对总 PLK1 蛋白（无论是否磷酸化）进行快速定量检测。Polo 样激酶 1（PLK1）是高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族中的核心成员，对细胞分裂（有丝分裂）至关重要，因此是细胞周期中 G2/M 检查点的关键调控因子。

PLK1 在细胞周期调控中的激活机制：PLK1 可被 AurA 激酶磷酸化苏氨酸 210（Thr210）位点而激活，激活后的 PLK1 会进一步磷酸化 CDC25。

PLK1 是调控有丝分裂及细胞周期进程 / 细胞增殖的关键蛋白，这使其成为极具吸引力的癌症治疗靶点。

工作原理

总 PLK1 检测原理

总 PLK1 检测可对细胞裂解液中 PLK1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。总 PLK1 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 PLK1 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 PLK1 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 PLK1 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估 PLK1 蛋白的表达水平。

assay-principle-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 检测原理）

总 PLK1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 PLK1 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

assay-protocol-how-it-works-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 双板检测方案）

总 PLK1 单板检测方案

使用均相时间分辨荧光（HTRF）试剂检测总 PLK1 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。

该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光（HTRF）检测质量。

assay-protocol-how-it-works-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 单板检测方案）

检测验证

HeLa 细胞中总 PLK1 及磷酸化 PLK1（Thr210 位点）的激活检测

将 HeLa 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜。随后用浓度递增的诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 50 微升（µL）补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度，1X），在室温（RT）下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升总 PLK1 或磷酸化 PLK1（Thr210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。在室温下孵育 18 小时后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：诺考达唑以剂量依赖方式诱导 PLK1 的表达及磷酸化，半数有效浓度（EC50）均为 60-70 纳摩尔（nM）。

assay-validation-activator-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 激活剂检测验证）

利用磷酸化 PLK1（Thr210 位点）和总 PLK1 检测 HeLa 细胞中抑制剂的特性

将表达 PLK1 的 HeLa 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用 200 纳摩尔诺考达唑与浓度递增的 CHK1 激活剂阿霉素（Doxorubicin 8）、两种 AuroraA 抑制剂（MLN8054 和 Alisertib）及蛋白降解剂（PROTAC）化合物 CC885 共同处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。之后移除培养基，加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化 PLK1（Thr210 位点）或总 PLK1 均相时间分辨荧光检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：所有测试化合物均能诱导 PLK1 磷酸化水平下降，但半数有效浓度（EC50）不同 —— 阿霉素为 54 纳摩尔，MLN8054 约为 6 微摩尔（µM），Alisertib 为 28 纳摩尔，蛋白降解剂 CC885 为 68 纳摩尔。

有趣的是，除 MLN8054 外，其他所有化合物均以相似方式降低 PLK1 的表达水平。

assay-validation-inhibitor-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（Thr210 位点）抑制剂检测验证）

assay-validation-inhibitor-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 抑制剂检测验证）

利用基因沉默（SiRNA）验证均相时间分辨荧光总 PLK1 检测的特异性与选择性

将 HeLa 细胞以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，用 25 纳摩尔的 ON-TARGETplus 小干扰 RNA（SiRNA，购自 Horizon Discovery）处理细胞，该小干扰 RNA 可特异性靶向 PLK1、PLK2、PLK3 和 PLK4；同时设置非靶向小干扰 RNA 处理组作为对照。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，更换为完全培养基，随后在 37°C 条件下继续孵育 24 小时。

孵育结束后，用 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升预混合的均相时间分辨荧光总 PLK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：用 PLK1 小干扰 RNA 处理的细胞，其总 PLK1 信号显著下调，与非靶向小干扰 RNA 转染组相比，信号降低 98%。

另一方面，用 PLK2、PLK3 和 PLK4 小干扰 RNA 处理的细胞，其信号未出现下降，这证明了该试剂盒具有特异性。

assay-validation-specificity-selectivity-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 检测特异性与选择性验证）

多种人源和鼠源细胞系的检测验证

将贴壁生长的人源细胞（HeLa、MCF7、Hep-G2）和鼠源细胞（NIH 3T3）以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 300 纳摩尔诺考达唑处理细胞，在 37°C 条件下孵育 16 小时。随后用补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升均相时间分辨荧光总 PLK1 检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：均相时间分辨荧光总 PLK1 检测可在表达不同水平 PLK1 蛋白的多种人源细胞模型中有效检测 PLK1 的表达，但在鼠源细胞模型中无法检测。

assay-validation-versatility-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 多细胞系检测验证）

均相时间分辨荧光总 PLK1 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。用 200 纳摩尔诺考达唑处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升均相时间分辨荧光总 PLK1 检测试剂。

取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。

结果显示：在此实验条件下，均相时间分辨荧光总 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

assay-validation-wb-comparison-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

PLK1 信号通路

PLK1（Polo 样激酶 1）在有丝分裂进程中发挥关键作用，近期研究表明，它还在 G2/M 检查点调控、DNA 损伤与复制应激反应及细胞死亡通路中具有重要作用。其信号传导机制较为复杂，涉及多个正反馈环路（如 Bora/AuroraA 通路）和负反馈环路（如 CHK1/ATR 或 CHK2/ATM 通路）。

PLK1 在细胞周期调控中的激活机制：PLK1 可被 AurA 激酶磷酸化 Thr210 位点而激活，激活后的 PLK1 会进一步磷酸化 CDC25。

在自噬 / 凋亡过程中，PLK1 通过多种信号通路（包括 mTOR、c-myc 和 p53 通路）参与多种细胞死亡过程。

近期文献报道了 PLK1 的新功能 —— 参与炎症和免疫反应调控，包括 NF-κB 和 RIG-I/MAV 信号通路。

上述所有生物学过程在肿瘤中均会发生异常改变，且研究发现 PLK1 在多种肿瘤类型中常呈高表达状态，而这种高表达与患者预后不良相关。因此，靶向 PLK1 已成为一种极具潜力的抗癌治疗策略。

pathway-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌（Brand）：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式（Detection Modality）：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格（Unit Size）：10000 次检测（10,000 assay points）

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