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HTRF (H) PLK1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测总 PLK1 蛋白（无论是否磷酸化）。 Polo 样激酶 1（PLK1）是高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族的主要成员，对细胞分裂（有丝分裂）至关重要。因此，它是细胞周期中 G2/M 检查点的关键调节因子。

细胞周期调控中的 PLK1 激活：PLK1 通过 AurA 激酶在苏氨酸 210（Thr210）位点的磷酸化而被激活。激活的 PLK1 会磷酸化 CDC25。

在 HeLa 细胞上使用磷酸化 PLK1（Thr210）和总 PLK1 进行抑制剂表征

将表达 PLK1 的 HeLa 细胞以 20,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用 200 nM 诺考达唑与不同浓度的 CHK1 激活剂阿霉素（Doxorubicin）、两种 AuroraA 抑制剂 MLN8054 和阿利塞替（Alisertib）以及 PROTAC 化合物 CC885 共同处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下处理 16 小时。随后移除培养基，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 PLK1 Thr210 或总 PLK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期所示，所有这些化合物均会降低 PLK1 的磷酸化水平，但半数有效浓度（EC50）不同：阿霉素为 54 nM，MLN8054 约为 6 µM，阿利塞替为 28 nM，PROTAC CC885 为 68 nM。

有趣的是，除 MLN8054 外，所有化合物均以相同方式降低 PLK1 的表达。

使用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 总 PLK1 检测的特异性和选择性

将 HeLa 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，HAPI 野生型细胞用 25 nM 的 ON-TARGETplus siRNA（Horizon Discovery）处理，这些 siRNA 分别特异性靶向 PLK1、PLK2、PLK3 和 PLK4，或用非靶向 siRNA（作为对照）处理。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，更换为完全培养基，然后将细胞在 37°C 条件下额外孵育 24 小时。

孵育后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 PLK1 检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 PLK1 SiRNA 处理细胞后，总 PLK1 信号显著下调，与转染非靶向 SiRNA 的细胞相比，信号降低 98%。

另一方面，用 PLK2、PLK3 和 PLK4 SiRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

在各种人类和小鼠细胞系上的验证

将贴壁的人类和小鼠细胞（HeLa、MCF7、Hep-G2 和 NIH 3T3）以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 300 nM 诺考达唑在 37°C 条件下处理细胞 16 小时。然后用补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 PLK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 PLK1 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的人类细胞模型中的 PLK1 表达，但在小鼠细胞模型中无法检测到。

HTRF 总 PLK1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养 24 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。用 200 nM 诺考达唑化合物在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时。然后用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 PLK1 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

PLK1 信号通路

Polo 样激酶 1（PLK1）在有丝分裂进程中起关键作用，最近的证据表明，它在调节 G2/M 检查点、DNA 损伤和复制应激反应以及细胞死亡通路中也具有重要作用。其信号机制相当复杂，涉及多个正反馈环（Bora/AuroraA 通路）和负反馈环（CHK1/ATR 或 CHK2/ATM 通路）。细胞周期调控中的 PLK1 激活：PLK1 通过 AurA 激酶在 Thr210 位点的磷酸化而被激活。然后，激活的 PLK1 会磷酸化 CDC25。在自噬 / 凋亡中，PLK1 通过多种信号通路（包括 mTOR、c-myc 和 p53）参与各种细胞死亡过程。最近，文献报道了 PLK1 的新作用，涉及它在调节炎症和免疫反应中的作用，包括 NFκB 和 RIG-I/MAV 信号通路。所有这些生物学过程在肿瘤中都会发生改变，且考虑到 PLK1 在几种肿瘤类型中经常过表达，这种过表达与患者预后不良相关。因此，靶向 PLK1 已成为一种有前景的抗癌治疗策略。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64PLKTPEY

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