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HTRF PLN P-S16 KIT - 10K PTS

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概述

这款基于细胞的检测试剂盒可检测丝氨酸 16（Ser16）位点磷酸化的受磷蛋白（PLN）。该磷酸化检测试剂盒与总受磷蛋白检测试剂盒搭配使用，是监测蛋白激酶 A（PKA）响应 G 蛋白偶联受体（GPCR）刺激（如 β2 肾上腺素能受体刺激）后激活情况的理想工具。蛋白激酶 A 可使受磷蛋白的 16 位丝氨酸残基发生磷酸化。

在未磷酸化状态下，受磷蛋白会抑制肌浆网钙 ATP 酶 2a（SERCA2a）—— 后者是调控心肌收缩力的钙泵。蛋白激酶 A（PKA）和钙调蛋白依赖性激酶 II（CaMKII）分别诱导受磷蛋白的 16 位丝氨酸（Ser16）和 17 位苏氨酸（Thr17）位点磷酸化，从而解除对肌浆网钙 ATP 酶 2a 的抑制。受磷蛋白的磷酸化状态可调控心脏中该钙泵的活性。

工作原理

磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测原理

磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测可对丝氨酸 16 位点磷酸化的受磷蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospholamban-phospho-s16-assay-principle（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测原理）

磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospholamban-phospho-s16-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）双板检测方案）

磷酸化受磷蛋白（苏氨酸 17 位点）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光（HTRF）试剂检测磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospholamban-phospho-s16-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）单板检测方案）

检测验证

心脏匀浆中的磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测

采用 Cisbio 裂解缓冲液对自发性高血压大鼠（SHR）心脏样本和京都威斯塔大鼠（WKY）心脏样本进行匀浆处理，离心后收集上清液。对总蛋白进行定量，并使用裂解缓冲液进行平行稀释。取 16 微升（µL）裂解液转移至 384 孔小体积（sv）白色微孔板，加入 4 微升磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）均相时间分辨荧光检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

assay-validation-pln-phospho-s16-1（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测验证 1）

高血压大鼠心脏裂解液中磷酸化受磷蛋白的对比检测

采用 Cisbio 裂解缓冲液对自发性高血压大鼠（SHR）心脏样本和京都威斯塔大鼠（WKY）心脏样本进行匀浆处理，离心后收集上清液。在总蛋白浓度固定（16.25 微克 / 毫升，µg/mL）的条件下，使用受磷蛋白苏氨酸 17 位点（Thr17）磷酸化检测试剂盒与受磷蛋白丝氨酸 16 位点（Ser16）磷酸化检测试剂盒进行平行对比检测。为实现检测标准化，同时对总受磷蛋白进行检测。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测试剂、磷酸化受磷蛋白（苏氨酸 17 位点）检测试剂或总受磷蛋白检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。数据结果均根据总受磷蛋白表达水平进行标准化处理。

**** t 检验分析，P 值＜0.0001

assay-validation-pln-phospho-s16-2（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测验证 2）

磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将自发性高血压大鼠（SHR）心脏匀浆离心 10 分钟后收集样本。取等量总蛋白，采用蛋白质印迹法（WB）与均相时间分辨荧光（HTRF）法进行平行对比检测。将 110 微克 / 毫升的总蛋白作为系列稀释的最高浓度。结果显示，磷酸化受磷蛋白均相时间分辨荧光检测的灵敏度优于蛋白质印迹法：仅需 0.49 微克 / 毫升的总蛋白即可检测到磷酸化信号，远低于蛋白质印迹法所需的 13.3 微克 / 毫升。

assay-validation-pln-phospho-s16-3（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

受磷蛋白简化信号通路

受磷蛋白（PLN）通过调控心肌肌浆网（SR）钙 ATP 酶 2a（SERCA2a），在心力衰竭过程中发挥关键作用。肌浆网钙 ATP 酶 2a 是一种位于肌浆网膜上的钙泵，激活后可将钙离子（Ca²⁺）转运至肌浆网内。肌浆网钙 ATP 酶 2a 活性不足是心力衰竭的典型特征。未磷酸化的受磷蛋白会抑制肌浆网钙 ATP 酶 2a，而蛋白激酶 A（PKA）介导的受磷蛋白 16 位丝氨酸位点磷酸化，或钙调蛋白依赖性激酶 II（CaMKII）介导的受磷蛋白 17 位苏氨酸位点磷酸化，均可逆转这种抑制作用。受磷蛋白的磷酸化状态可调控该钙泵的活性：受磷蛋白去磷酸化可驱动心肌舒张，磷酸化则可驱动心肌收缩。

受磷蛋白是一种小分子蛋白质，存在于心肌、平滑肌和慢肌纤维骨骼肌中，但其调控作用主要在心肌中被研究。目前对其激活过程的了解尚不充分，但已知其存在两条主要信号通路，可分别导致两个不同位点的磷酸化 ——16 位丝氨酸位点或 17 位苏氨酸位点。β 受体激动剂与受体结合后激活 G 蛋白，G 蛋白进而增强腺苷酸环化酶（AC）活性；腺苷酸环化酶催化环磷酸腺苷（cAMP）生成，环磷酸腺苷再激活蛋白激酶 A。蛋白激酶 A 可磷酸化 L 型钙通道（增加钙离子内流）、蛋白磷酸酶 1（PP1）以及受磷蛋白的 16 位丝氨酸残基。细胞内钙离子浓度升高会激活钙调蛋白依赖性激酶 II，该酶的自身磷酸化状态也受蛋白磷酸酶 1 调控；随后，钙调蛋白依赖性激酶 II 可磷酸化受磷蛋白的 17 位苏氨酸残基。

phospho-pathway-phospholamban-phospho-s16-kit-64pln16peg（图示：磷酸化受磷蛋白（丝氨酸 16 位点）试剂盒信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌（Brand）：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式（Detection Modality）：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：磷酸化（Phosphorylation）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）：心血管领域（Cardiovascular）
单位规格（Unit Size）：10000 次检测（10,000 assay points）

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