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HTRF PLN P-S16 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于细胞的检测方法能够检测丝氨酸 16（Serine 16）位点磷酸化的受磷蛋白（Phospholamban，PLN）。该磷酸化检测与总 PLN 检测相结合，是监测 G 蛋白偶联受体（GPCR）刺激（如 β2 肾上腺素受体刺激）后蛋白激酶 A（PKA）激活的理想工具。PKA 可使 PLN 的丝氨酸 16（Ser 16）残基磷酸化。

在未磷酸化状态下，PLN 会抑制肌浆网钙 ATP 酶 2a（SERCA2a），而 SERCA2a 是控制心肌收缩力的钙泵。PKA 和钙调蛋白依赖性激酶 II（CaMKII）分别在 Ser16 和 Thr17 位点诱导 PLN 磷酸化，从而解除对 SERCA2a 的抑制。PLN 的磷酸化状态调控着心脏中这种钙泵的活性。

工作原理

磷酸化受磷蛋白（Ser16）检测原理

磷酸化受磷蛋白（Ser16）检测用于测量 Ser16 位点磷酸化的受磷蛋白。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化受磷蛋白（Ser16）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化受磷蛋白（Ser16）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化受磷蛋白（Ser16）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化受磷蛋白（Thr17）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化受磷蛋白（Ser16）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

心脏匀浆中的 Ser16 磷酸化受磷蛋白检测

使用 Cisbio 裂解缓冲液匀浆自发性高血压大鼠（SHR）心脏和京都威斯塔大鼠（WKY）心脏样本，离心后收集上清液。对总蛋白进行定量，并在裂解缓冲液中进行平行稀释。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化受磷蛋白（Ser16）检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

高血压大鼠心脏裂解物中磷酸化受磷蛋白的比较

使用 Cisbio 裂解缓冲液匀浆自发性高血压大鼠（SHR）心脏和京都威斯塔大鼠（WKY）心脏样本，离心后收集上清液。在固定的总蛋白浓度（16.25 µg/mL）下，对 HTRF 磷酸化 Thr17 PLN 试剂盒、磷酸化 Ser16 PLN 试剂盒进行平行比较。为了使检测结果标准化，还对总受磷蛋白进行了检测。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化受磷蛋白（Ser16）检测试剂、磷酸化受磷蛋白（Thr17）检测试剂或总受磷蛋白检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。数据在总表达水平标准化后呈现。

**** t 检验分析 P 值 < 0.0001

HTRF Ser16 磷酸化 PLN 检测与蛋白质印迹法的比较

离心 10 分钟后收集自发性高血压大鼠（SHR）心脏匀浆。使用等量的总蛋白进行蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 的平行比较。将 110 µg/mL 的总蛋白作为系列稀释的最高浓度。HTRF 磷酸化 PLN 检测显示出比 WB 更高的灵敏度，因为 0.49 µg/mL 的总蛋白就足以检测到磷酸化，远低于 WB 所需的 13.3 µg/mL。

简化通路

PLN 的简化通路

受磷蛋白（PLN）通过对心肌肌浆网（SR）钙 ATP 酶（SERCA2a）的调控，在心力衰竭中发挥关键作用。该蛋白含有一个位于肌浆网膜中的钙泵，激活后钙会进入肌浆网。SERCA2a 活性不足是心力衰竭的一个标志。去磷酸化的 PLN 会抑制 SERCA2a，而 PLN 在 Ser16 位点被 PKA 磷酸化或在 Thr17 位点被 CaMKII 磷酸化则会逆转对 SERCA2a 的抑制。PLN 的磷酸化状态调控着这种钙泵的活性。PLN 的去磷酸化驱动舒张，而其磷酸化状态则驱动收缩。

这种小蛋白存在于心肌、平滑肌和慢肌纤维骨骼肌中。然而，其调控作用主要在心肌中进行了研究。其激活过程尚不完全清楚，但已知有两条主要通路会导致两种不同的磷酸化：丝氨酸 16（Serine 16）残基或苏氨酸 17（Threonine 17）残基的磷酸化。β 受体激动剂与其受体结合会激活 G 蛋白，从而增强腺苷酸环化酶（AC）的活性。AC 催化环磷酸腺苷（cAMP）的形成，进而激活 PKA。PKA 使 L 型钙通道磷酸化，增加钙内流，并使 PP1 和 PLN 的 Ser16 残基磷酸化。细胞内钙浓度的增加会激活 CaMKII。这种自身磷酸化状态也受 PP1 调控。CaMKII 进而使 PLN 的 Thr17 残基磷酸化。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64PLN16PEY

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